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光敏色素a过表达对花生株型的影响及机理研究

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光敏色素A过表达对花生株型的影响及机理研究

作者：石素华山东师范大学

学位级别：硕士

株型是植物的重要性状,它会影响作物的产量和对环境的适应能力,受到严格的遗传控制,植物株型包括株高、叶型、分枝数目、分枝角度、花序等。株高是影响植物株型和反映植物长势的重要性状,花序是植物的花在花枝上的排列和开花方式,大豆... 详细信息

株型是植物的重要性状,它会影响作物的产量和对环境的适应能力,受到严格的遗传控制,植物株型包括株高、叶型、分枝数目、分枝角度、花序等。株高是影响植物株型和反映植物长势的重要性状,花序是植物的花在花枝上的排列和开花方式,大豆中研究表明,花序轴的长短与产量密切相关,花序轴越长,大豆产量越高。花序轴越长,植物首次开花时间越晚,花期延长,出现晚花的表型。影响植物株型的因素多种多样,除了受外界环境因素的影响外,还受到植物激素、细胞周期关键基因、细胞壁合成关键基因等因素的影响。光敏色素a是远红光受体,研究表明,拟南芥phyA过表达株系出现植株矮化的表型,烟草中异源表达燕麦phyA导致有生物活性的赤霉素(GAs)减少,植株矮化,叶面喷施赤霉素可以抑制这种反应。水稻phyA过量表达株系胚芽鞘伸长受抑制,成熟的转基因水稻植株在株高、节间长度等方面显著降低,并且单株穗数增加。可见,phyA在植物株型调控过程中发挥重要作用,但是对其调控机制未进行深入研究。实验室前期获得了表型稳定的AhphyA过量表达株系(OEphyA),OEphyA出现植株矮化和花序轴伸长等表型。本研究利用OEphyA为材料,分析了OEphyA株高,分枝,花序轴等性状的变化,研究了光质对OEphyA下胚轴和根发育的影响;并通过数字基因表达谱分析、激素含量测定以及外源激素处理等方法进一步研究了phyA对株高矮化以及花序轴伸长的调控机理。主要研究结果如下:1.不同光质对下胚轴及根长的影响:在红光、远红光、黑暗、白光四种条件下,分别对萌发6天、9天、12天的OEphyA和LH14下胚轴和根长度进行测量统计。结果表明,OEphyA下胚轴的长度在红光、远红光、白光条件下都显著短于LH14。OEphyA根的长度在红光、远红光和黑暗条件下都显著大于LH14,而在白光条件下没有差异。***表型分析:在花生成熟期OEphyA的主茎高度和侧枝长度都显著短于LH14。OEphyA第一朵花开花时间要晚于LH14 6天。叶绿素测定结果表明,,OEphyA未展开的嫩叶中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量都显著低于LH14。而OEphyA的主茎倒数第三节上的成熟叶片的叶绿素a和b含量都显著高于LH14,说明成熟叶片中phyA过量表达促进叶绿素积累。3.花生地上未膨大果针数字基因表达谱分析:光敏色素基因在花生中过量表达,引起了一系列基因表达的变化,其中包括光信号,激素信号,细胞壁形成以及胚胎发育相关的基因。在表达谱中OEphyA株系AhphyA表达上调1.32倍,通过qRT-PCR验证,OEphyA中AhphyA上调4.24倍,这说明phyA在花生中过量表达后RNA水平显著上调。另外,生长素相关基因,ABA信号相关基因,以及乙烯信号转导相关基因在OEphyA表达水平相对较低,而GA信号相关基因的表达量较高,gibberellin 20 oxidase 2-like表达下调显著。因此,我们推测这些GA相关的基因变化可能最终导致GA含量下调,从而导致OEphyA出现矮化表型。4.花生叶片数字基因表达谱分析及激素含量的测定:花生幼苗叶片数字基因表达谱分析结果表明,赤霉素合成相关的基因表达下调而降解相关的基因上调,这同样证明了OEphyA矮化可能与赤霉素有关。促进开花的相关基因下调,所以OEphyA出现晚花的表型。激素测定结果表明,与对照LH14比OEphyA中IAA含量变化不显著,GA含量显著降低,因此,我们进一步推测OEphyA矮化的表型可能是GA含量下降导致的。5.外源GA及其抑制剂对LH14和OEphyA植株生长的影响:用GA及其合成抑制剂处理苗龄14天的LH14和OEphyA花生幼苗,结果表明,对照条件下,OEphyA主茎高度显著矮于LH14,说明AhphyA过量表达对主茎高度具有抑制作用。GA处理后,转基因植株和对照LH14主茎高度没有显著差异,说明GA处理可以恢复OEphyA主茎高度矮化的表型。外源施加GA抑制剂对LH14主茎高度的抑制程度与AhphyA过量表达对主茎高度的抑制程度相似。因此,我们认为,AhphyA过量表达引起的株型矮化主要是由于植物体内GA水平下降导致的。***花序轴伸长研究:与对照LH14比,OEphyA株系的花序轴显著伸长,花生果针数量增多,单株的结果数增多,为探究OEphyA花序轴伸长的分子机理,以LH14和OEphyA花序轴为材料,进行表达谱分析和激素含量的测定,结果表明OEphyA花序轴中GA和IAA含量显著增加,因此,我们推测OEphyA花序轴的伸长可能与赤霉素和生长素相关。

关键词：花生株型光敏色素a 数字基因表达谱下胚轴赤霉素

玉米2个光敏色素a基因的克隆、蛋白结构与光诱导表达模式

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中国农业科学 2010年第10期43卷 1985-1993页

作者：马燕斌李壮蔡应繁周朋肖阳黄玉碧付凤玲潘光堂杨克诚杨建平四川农业大学玉米研究所中国农业科学院作物科学研究所重庆邮电大学生物信息学院中国农业科学院研究生院

【目的】分析玉米2个光敏色素a基因(ZmPhyA1和ZmPhyA2)的蛋白结构及可能存在的功能区段,明确其响应于不同光线处理的表达模式。【方法】通过RT-PCR方法获得ZmPhyA1和ZmPhyA2编码的完整cDNA序列,推断2个基因编码蛋白的保守结构域,利用酵... 详细信息

【目的】分析玉米2个光敏色素a基因(ZmPhyA1和ZmPhyA2)的蛋白结构及可能存在的功能区段,明确其响应于不同光线处理的表达模式。【方法】通过RT-PCR方法获得ZmPhyA1和ZmPhyA2编码的完整cDNA序列,推断2个基因编码蛋白的保守结构域,利用酵母双杂交测试其结构域间的物理互作,利用半定量RT-PCR技术分析不同光处理条件下ZmPhyA1和ZmPhyA2的表达模式。【结果】遗传进化树分析表明,ZmPHYA2与高粱光敏色素a的遗传关系要比与ZmPHYA1更近。ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白中含有1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个HisKinaseA结构域和1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构。ZmPHYA1与ZmPHYA2自身和相互之间可以通过其C端539个氨基酸区段进行相互作用。ZmPhyA1和ZmPhyA2在黑暗、远红光和蓝光条件下表达量较高,在红光和白光条件下较低,并且前者的表达量均低于后者。【结论】ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白是2个具有功能的光受体蛋白,自身和相互之间可能通过C端539个氨基酸区段互作形成复合体,二者的表达水平受不同光质的调控。

关键词：玉米光敏色素a 蛋白互作表达分析

破坏光敏色素a改变生长素反应因子8的表达谱

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植物学报 2009年第4期44卷 434-441页

作者：王海周玉萍王小兰林芳段俊田长恩广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室广州510006 中国科学院华南植物园广州510650 广州大学生命科学学院广州510006

拟南芥生长素反应因子8(auxin response factor 8,ARF8)受光诱导表达,涉及光信号转导。为阐明光信号通过光受体传递给ARF8的过程和机理,首先利用半定量RT-PCR分析发现,PhyA的突变促进幼苗中ARF8的表达,而PhyB、Cry1和Cry2的突变对ARF8... 详细信息

拟南芥生长素反应因子8(auxin response factor 8,ARF8)受光诱导表达,涉及光信号转导。为阐明光信号通过光受体传递给ARF8的过程和机理,首先利用半定量RT-PCR分析发现,PhyA的突变促进幼苗中ARF8的表达,而PhyB、Cry1和Cry2的突变对ARF8的表达没有明显影响。进而,利用GUS染色以及半定量和定量RT-PCR方法,系统分析PhyA基因的突变对ARF8基因表达的影响。结果表明,在黑暗、白光和远红光条件下,PhyA突变均明显提高拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗子叶和叶片中ARF8的表达水平,并且明显降低其在幼苗下胚轴、茎尖和根尖中的表达水平。上述结果说明,PhyA基因的突变组成型地改变了ARF8基因的表达谱。然而,ARF8的突变并未明显改变PhyA的表达。说明在远红光信号通路中,ARF8位于PhyA的下游。

关键词：生长素反应因子8 远红光信号基因表达基因突变光敏色素a

拟南芥光敏色素a反义RNA载体的构建及转化

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广西植物 2009年第5期29卷 669-672页

作者：王海王小兰周玉萍段俊田长恩中国科学院华南植物园广州510650 广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点实验室广州510006 中国科学院研究生院北京100049

光敏色素a是植物远红光信号的关键受体,在植物光信号转导途径中起重要作用。一些具有重要功能的基因(如生长素反应因子8:auxin response factor 8,ARF8)受到PhyA调控。本实验拟通过构建PhyA基因反义株系,研究PhyA调控ARF8等重要功能基... 详细信息

光敏色素a是植物远红光信号的关键受体,在植物光信号转导途径中起重要作用。一些具有重要功能的基因(如生长素反应因子8:auxin response factor 8,ARF8)受到PhyA调控。本实验拟通过构建PhyA基因反义株系,研究PhyA调控ARF8等重要功能基因表达的机理。以培养7 d的拟南芥幼苗为材料提取RNA,利用RT-PCR技术扩增出PhyA的全长CDS,将其反向插入表达载体pMD1得到反义表达载体pMD1-PhyA CDSR,并通过农杆菌介导转化拟南芥,经卡那霉素抗性平板筛选和PCR鉴定得到13个PhyA转基因株系。pMD1-PhyA CDSR及其转基因株系的获得为研究PhyA调控ARF8等基因表达的机理奠定了材料基础。

关键词：光敏色素a 反义表达载体拟南芥生长素反应因子8

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三叶木通光敏色素a基因的序列及表达分析

广西植物 2016年第9期36卷 1061-1067+1081页

作者：李慧丽韩兴杰廖亮徐玲玲江西农业大学园林与艺术学院九江学院药学与生命科学学院

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物体内最重要的光受体,参与调节植物种子萌发、幼苗生长、茎的伸长、子叶伸展直至开花控制等许多生理过程。该研究通过RT-PCR方法首次从三叶木通(Akebia trifoliata)中获得了编码光敏色素a的c DNA序列... 详细信息

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物体内最重要的光受体,参与调节植物种子萌发、幼苗生长、茎的伸长、子叶伸展直至开花控制等许多生理过程。该研究通过RT-PCR方法首次从三叶木通(Akebia trifoliata)中获得了编码光敏色素a的c DNA序列(命名为Aktr PHYA1,Gen Bank登录号为KP864055)。结果表明:该序列由3 496 bp组成,包含一个3 426 bp的完整开放阅读框,编码1 141个氨基酸。Aktr PHYA1编码的蛋白N端为光感受区域,包括一个GAF结构域、一个PHY结构域;C端为光调节区域,C端包括两个PAS结构域、一个组氨酸激酶A结构域和一个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构。同源蛋白比对显示,Aktr PHYA1与耧斗菜、荷花的同源蛋白序列一致性分别为83%和82%。遗传进化树分析表明,单子叶植物和双子叶植物的光敏色素a基因分别聚为两支;在双子叶植物中,Aktr PHYA1与耧斗菜、荷花PHYA聚在一起,说明三叶木通与耧斗菜、荷花遗传关系较近。Aktr PHYA1在三叶木通茎、叶片、雄花、雌花、种子中均有表达,且在种子中表达最强,在叶片中表达量最低。Aktr PHYA1的组织表达谱暗示了其在植物中可能的功能。该研究结果为三叶木通光敏色素a基因的功能研究奠定了基础。

关键词：三叶木通光敏色素a 序列分析表达分析

高粱光敏色素a基因的克隆、蛋白结构与长短日照诱导表达模式

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分子植物育种 2020年第6期18卷 1748-1754页

作者：王平王春语赵子良丛玲陆晓春辽宁省农业科学院创新中心沈阳110866 沈阳农业大学农学院沈阳110866 广西大学农学院南宁530004

光敏色素是一类红光/远红光受体,对植物光形态建成、外部形态和生理功能等方面起着重要的调节作用。为明晰光敏色素a在调控高粱光形态建成发育过程中的作用,本研究比较分析光温敏感程度不同的高粱品种Btx623、Rio、Tx430和LH645的PhyA... 详细信息

光敏色素是一类红光/远红光受体,对植物光形态建成、外部形态和生理功能等方面起着重要的调节作用。为明晰光敏色素a在调控高粱光形态建成发育过程中的作用,本研究比较分析光温敏感程度不同的高粱品种Btx623、Rio、Tx430和LH645的PhyA基因序列和PHYA蛋白的保守结构域,利用qRT-PCR明确长短日照条件处理下PhyA基因的表达模式。结果表明,Btx623、Rio和Tx430之间PhyA基因序列存在非同义突变,LH645在PhyA基因的第7个外显子上插入了5 bp碱基序列;高粱PhyA蛋白中含有1个PAS-2结构域、1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个组氨酸激酶A结构域和1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构;遗传进化树分析表明,单子叶和双子叶植物PhyA蛋白明显聚为2大类,高粱PhyA、谷子PhyA和玉米PhyA1、PhyA2聚为一个亚类,相互间亲缘关系较近,与水稻PhyA同源性相对较远;在短日照(SD)条件下各时期PhyA基因转录水平变化显著,Rio PhyA基因转录水平较Btx623和Tx430变化明显,LH645 PhyA基因转录变化不显著,在长日照(LD)条件下Rio PhyA基因转录水平低于Btx623和Tx430,LH645 PhyA基因转录水平变化不显著。以上结果表明,PhyA受光周期诱导,推测其在高粱光形态建成中起重要调控作用。本研究为进一步解析PhyA基因功能及其在调控高粱光形态建成发育过程中的作用提供理论基础。

关键词：高粱(Sorghum bicolor) 光敏色素a 表达模式长/短日照处理

紫花苜蓿光敏色素a（phyA）基因片段的克隆及其RNA干扰（RNAi）载体的构建

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紫花苜蓿光敏色素A（phyA）基因片段的克隆及其RNA干扰（RNAi）载...

作者：张亚军河南农业大学

学位级别：硕士

苜蓿的秋眠性可能是一种光周期效应。光敏色素a(phytochrome,phyA)作为植物体内最重要的光受体,在调控苜蓿秋眠性上可能发挥了重要作用。本研究根据RNA干扰(RNAi)技术的原理克隆phyA基因片段,构建其对应的RNAi表达载体,为特异性阻断该... 详细信息

苜蓿的秋眠性可能是一种光周期效应。光敏色素a(phytochrome,phyA)作为植物体内最重要的光受体,在调控苜蓿秋眠性上可能发挥了重要作用。本研究根据RNA干扰(RNAi)技术的原理克隆phyA基因片段,构建其对应的RNAi表达载体,为特异性阻断该基因表达,得到缺失phyA基因无秋眠表型的植株奠定了基础,从而为确定该基因在苜蓿秋眠性中的功能奠定了基础。本试验以自然条件下生长的半秋眠型苜蓿的幼嫩叶片为材料,采用碱裂解法提取RNA。根据RNAi载体的构建原则,选取phyA-开放阅读框上的一段,并设计携带酶切位点的特异引物,采用RT-PCR法分别克隆1段长604bp的正反向基因片段,根据相应的酶切位点将正反两片段连入中间载体pKANNIBAL,然后经NotI酶切,将含有启动子、终止子、内含子及phyA正反片段构成的可以形成发夹结构的片段连入表达载体pART27。得到以下试验结果:(1)建立了苜蓿phyA基因片段RT-PCR克隆的反应体系,克隆得到的片段经测序分析其序列与光敏色素a基因相似度达到99%以上,判断其为苜蓿光敏色素a基因片段。通过BLAST比对分析,与苜蓿其他基因相似度低,可以进行下一步试验。(2)得到片段与载体连接的适宜比例。(3)经电泳检测与酶切鉴定,成功将苜蓿phyA基因正反片段连入中间载体pKANNIBAL,以形成发夹结构。(4)经过电泳检测与酶切鉴定,已将发夹结构连入植物双元表达载体pART27,成功构建了干扰phyA基因表达的RNAi载体。(5)将phyARNAi载体转入农杆菌。结果表明,本试验的成功为进行农杆菌感染植物材料,阻断phyA基因表达,得到缺失phyA无秋眠表型的植株创造了条件。

关键词：紫花苜蓿光敏色素a RNAi表达载体载体pKANNIBAL 载体pART27

强遮荫条件下光敏色素a介导的耐荫反应机制初步研究

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强遮荫条件下光敏色素A介导的耐荫反应机制初步研究

作者：伍淑娟厦门大学

学位级别：硕士

自然界中的植物应对遮荫环境,主要有两种生长策略,分别是避荫反应和耐荫反应。避荫反应的表型包括茎和叶柄快速伸长、叶绿素含量减少等,统称为避荫综合征,而耐荫反应的表型主要包括比叶面积增加,叶绿素a/b比例减小等。目前关于避荫反应... 详细信息

自然界中的植物应对遮荫环境,主要有两种生长策略,分别是避荫反应和耐荫反应。避荫反应的表型包括茎和叶柄快速伸长、叶绿素含量减少等,统称为避荫综合征,而耐荫反应的表型主要包括比叶面积增加,叶绿素a/b比例减小等。目前关于避荫反应的分子机制已有相对完善的研究体系,但耐荫反应的分子机制还没有明确的阐释。在我们的强遮荫培养条件(R:FR=0.1)下,野生型Col-0的下胚轴不像遮荫条件(R:FR=0.6)下一样伸长,而是表现出与白光相似的长度;在叶绿素含量方面,强遮荫条件下的叶绿素含量明显比遮荫条件高,说明避荫植物拟南芥在强遮荫条件下抑制避荫反应,从而产生耐荫反应。光敏色素a(PHYA)突变体在强遮荫条件下,下胚轴长度与遮荫条件一样高,叶绿素含量相对遮荫条件回升的幅度比野生型少,也就是说,phyA突变体在强遮荫条件下的耐荫表型出现缺陷或减弱,说明光敏色素a促进强遮荫条件下耐荫反应的发生。我们发现将突变体pif4pif5与phyA突变体杂交后,phyA突变体在强遮荫条件下的下胚轴伸长受到部分抑制,说明光敏色素a在强遮荫条件下对下胚轴伸长的抑制是部分依赖于PIF4/PIF5的。而将突变体cop1.4与phyA突变体杂交后,双突变体在强遮荫条件下的下胚轴长度、叶绿素含量以及光敏色素a下游基因的转录水平都和cop1.4单突变体相似,说明COP1在光敏色素a的下游影响了光敏色素a在强遮荫条件下对耐荫的调控。前期研究者董康梅对强遮荫条件下phyA突变体中被下调的基因进行共表达分析发现,绝大部分基因的表达在ABA处理、蔗糖处理以及低氧处理等相关胁迫条件下也被下调。所以,我们推测光敏色素a在强遮荫条件下的调控可能与ABA、能量和低氧等胁迫相关。在我们的研究中发现,蔗糖处理能消除拟南芥在强遮荫条件下的耐荫表型,说明强遮荫处理可能影响了植物的能量代谢,进而产生耐荫反应。强遮荫条件能显著激活植物中的生长抑制途径-SnRK1途径,而光敏色素a参与了对这一激活过程的抑制。此外,我们发现ABA信号转导相关基因ABI1/ABI2/PP2CA在phyA突变体中出现更明显的转录激活,说明光敏色素a可能参与了遮荫与强遮荫条件下对ABA信号转导途径的抑制。在我们的Microarray结果中显示,ERF72在遮荫与强遮荫处理24小时在野生型Col-0与phyA-211突变体中被同等程度地显著激活,说明ERF72的转录水平可能既不受遮荫与强遮荫的差异调控,也不受PHYA调控。我们发现ERF72的表达在遮荫处理的PIFs相关突变体(pifl-2、pif4pif5和pif7-2)、cop1.4突变体、ABA途径相关突变体(aba2-1,abi4,abi1-1,abi3-5)、生长素合成突变体(sav3-1)以及生长促进因子TOR转基因沉默突变体中与Col-0相比也没有明显差别,说明ERF72在遮荫条件下的转录激活既不受常见光信号转导元件PIFs与COP1的调控,也不受ABA途径、生长素途径和能量相关的TOR途径调控。然而,在遮荫处理24小时时,ERF72在乙烯信号转导重要组份EIN3/EIN2相应突变体中出现转录激活部分降低或缺陷,在叶绿素合成相关突变体cch中也出现转录激活的部分降低,说明乙烯途径正向调控了 ERF72在遮荫条件下的转录激活,EIN2起主要调控作用,叶绿素也影响了 ERF72在遮荫条件下的转录激活。

关键词：强遮荫耐荫反应光敏色素a

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植物远红光受体——光敏色素a的研究进展

自然杂志 2019年第3期41卷 188-196页

作者：周杨杨李继刚中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室

光敏色素是植物中感受红光和远红光的光受体,而光敏色素a(phyA)是植物中唯一感受并响应远红光信号的光受体。phyA以Pr形式在细胞质中合成,接受光照后被激活,转换为具有生物活性的Pfr形式。Pfr形式的phyA与穿梭蛋白FHY1/FHL结合并被转运... 详细信息

光敏色素是植物中感受红光和远红光的光受体,而光敏色素a(phyA)是植物中唯一感受并响应远红光信号的光受体。phyA以Pr形式在细胞质中合成,接受光照后被激活,转换为具有生物活性的Pfr形式。Pfr形式的phyA与穿梭蛋白FHY1/FHL结合并被转运进入细胞核,在细胞核中与FHY1/FHL分离;FHY1/FHL出核,进行下一个转运phyA进入细胞核的循环。近年发展的phyA数学模型指出,phyA受体Pr与Pfr形式间的转换,以及特异性依赖FHY1/FHL转运进入细胞核,决定其成为植物远红光的光受体。在细胞核中,激活形式的phyA与COP1和SPA蛋白直接相互作用,抑制其形成有功能的E3泛素连接酶复合体;从而使转录因子HY5等蛋白能够积累,促进光形态建成的发生。Pfr形式的phyA也可以与转录因子PIFs相互作用,并介导PIFs的快速磷酸化和降解,从而解除PIFs对光形态建成的抑制作用。FHY3和FAR1是转座酶衍生的一类转录因子,能够在远红光下直接激活FHY1/FHL的基因表达;而HY5能够负反馈调控FHY3/FAR1对于FHY1/FHL的转录激活作用,从而维持远红光信号的动态平衡。Pfr形式的phyA在细胞核内能够被磷酸化,磷酸化的phyA是COP1/SPA的E3泛素连接酶复合体优先降解的底物;而最新的研究表明,磷酸化的phyA可能是一种活性更强的形式,在诱导植物远红光信号响应中扮演重要的角色。

关键词：光敏色素a 远红光受体磷酸化信号转导