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eEF1A1对光动力治疗中光敏剂ppix在肿瘤细胞内富集的作用机制研究

eEF1A1对光动力治疗中光敏剂PpIX在肿瘤细胞内富集的作用机制研究

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作者：崔晓君复旦大学

学位级别：硕士

近十年来,5-ALA诱导的肿瘤光动力治疗获得了越来越多的关注,肿瘤中积累大量的ppix是5-ALA诱导的ppix应用于光动力治疗和诊断的基础。但是,在PDT中,光敏剂积累的机制目前并不十分明确,PDT的有效性和安全性主要依赖于光敏剂的肿瘤高选择... 详细信息

近十年来,5-ALA诱导的肿瘤光动力治疗获得了越来越多的关注,肿瘤中积累大量的ppix是5-ALA诱导的ppix应用于光动力治疗和诊断的基础。但是,在PDT中,光敏剂积累的机制目前并不十分明确,PDT的有效性和安全性主要依赖于光敏剂的肿瘤高选择性摄取,提高光敏剂的选择性积聚能力,可以大大提高光敏剂的治疗效果。本课题组之前以光敏剂ppix为探针,通过亲和淘洗、分子印迹技术及荧光分析技术,从人肝cDNA噬菌体展示库中筛选到一种光敏剂结合蛋白,经过基因序列分析发现,该蛋白为人类翻译延伸因子eEF1A1蛋白C末端25个氨基酸,并分别通过ELISA和Biacore的方法验证两者在体外确实存在结合作用。在本论文中,我们对光敏剂结合蛋白eEF1A1在细胞内与光敏剂ppix的亲和作用及eEF1A1介导的细胞内ppix富集作用进行了验证,并且初步探讨了eEF1A1在光敏剂富集于肿瘤细胞中的作用机制。一、通过5-ALA培养HepG2,使细胞内富集ppix,通过细胞免疫组化的方法,用FITC标记细胞内表达的eEF1A1蛋白,使用共聚焦显微镜和尼康超分辨显微镜观察到两者在细胞内存在共定位,验证两者在细胞内的亲和作用。二、已经有研究表明,eEF1A1在肿瘤细胞中的表达量高于正常细胞,因此,为了研究细胞中eEF1A1对ppix的积累是否有影响,我们检测ALA培养后,L02和HepG2细胞中ppix的含量情况。之后,我们用实验室构建的可融合表达绿色荧光蛋白和eEF1A1的pEGFP-C1-eEF1A1重组质粒,转染HepG2细胞,观察到eEF1A1高表达细胞中ppix的富集量增加,进一步验证eEF1A1作为肿瘤细胞富集ppix的关键因子存在。三、为了进一步研究eEF1A1影响细胞中ppix变化的机制,我们向细胞裂解液中外源加入eEF1A1和ppix,通过M5酶标仪检测ppix荧光强度的变化。发现,外源加入eEF1A1后,ppix荧光强度下降明显变慢,这些结果为eEF1A1介导的ppix提供了一种新的解释,eEF1A1通过与ppix结合,阻止了ppix的降解或转化,从而造成了细胞中ppix的积累。本研究首次明确光敏剂ppix在肝癌细胞HepG2细胞中存在相互作用的蛋白eEF1A1,为探讨PDT光敏剂ppix选择性富集于肿瘤细胞的作用机制提供依据,为提高肿瘤光动力治疗效果奠定了基础。

关键词： eEF1A1 光动力治疗光敏剂ppix 肿瘤细胞

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