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鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶催化结构域的表达及纯化

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中国免疫学杂志 2007年第2期23卷 151-153页

作者：张睿迟宝荣朱学伟王俊懿吉林大学第一医院长春130021 吉林大学第三医院长春130031 中国科学院生物物理研究所

目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段。方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3GTcd。利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性。结... 详细信息

目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段。方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3GTcd。利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性。结果:①成功地构建了带有His-tag的α1,3GTcd重组质粒。②可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd。③利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3GTcd的活性。结论:可溶性地表达了α1,3GTcd。

关键词： α-1,3-半乳糖基转移酶 α-gal表位催化结构域 pET-15b

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钙调神经磷酸酶催化结构域的活性和性质

科学通报 2000年第4期45卷 381-386页

作者：杨淑杰张丽魏群 ***) 北京师范大学生命科学学院生物化学及分子生物学系北京100875

钙调神经磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ＣＮ）是唯一的Ｃａ２＋／钙调素（Ｃａｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）依赖的蛋白磷酸酶，由催化亚基Ａ（ＣＮＡ，６１ｋｕ）和调节亚基Ｂ（ＣＮＢ，１９ｋｕ）１：１组成．用ＰＣＲ方法构建... 详细信息

钙调神经磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ，ＣＮ）是唯一的Ｃａ２＋／钙调素（Ｃａｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）依赖的蛋白磷酸酶，由催化亚基Ａ（ＣＮＡ，６１ｋｕ）和调节亚基Ｂ（ＣＮＢ，１９ｋｕ）１：１组成．用ＰＣＲ方法构建了仅含ＣＮＡ催化结构域的编码区ｃＤＮＡ序列．经在Ｅ．ｃｏｌｉ中诱导表达，纯化，制备了ＣＮＡ催化结构域多肽．以ＰＮＰＰ为底物，研究了其磷酸酶活力．结果表明，在有ＣａＭ和ＣＮＢ时，其活性为ＣＮＡ活性的２０倍．ＣＮＡ催化结构域多肽的最适反应温度为４０℃，其最适反应ｐＨ值为８．０．不同离子对其活性的影响为：Ｍｎ２＋仍为其强激活剂，但ＣＮＡ催化结构域多肽不再受Ｃａ２＋的调节．在６ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋存在下，加Ｃａ２＋或ＥＧＴＡ，催化结构域多肽的活性相同．

关键词：钙调神经磷酸酶蛋白磷酸酶催化结构域活性脑

人酪氨酸羟化酶全长及催化结构域序列表达产物酶活性比较

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神经解剖学杂志 2003年第2期19卷 129-134页

作者：熊英杨慧于培兰徐群渊首都医科大学生物化学教研室北京神经科学研究所北京100054

采用人的全长酪氨酸羟化酶 c DNA为模板 ,设计特定的引物进行 PCR扩增反应 ,获得编码 N-端缺失 14 1个氨基酸的催化结构域 c DNA片段 ,将其插入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX-4 T-1中 ,构建表达质粒 p GEXTHc,同时构建其全长片... 详细信息

采用人的全长酪氨酸羟化酶 c DNA为模板 ,设计特定的引物进行 PCR扩增反应 ,获得编码 N-端缺失 14 1个氨基酸的催化结构域 c DNA片段 ,将其插入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX-4 T-1中 ,构建表达质粒 p GEXTHc,同时构建其全长片段的表达质粒 p GEXTHa。两者分别转化大肠杆菌 BL2 1,以 IPTG诱导可高效表达 ,产物以可溶形式存在 ,经亲和层析纯化后以蛋白酶裂解 ,再经亲和层析分离得到较纯的酶蛋白 ,采用高效液相色谱法 ( HPLC-ECD)检测酶活性 ,结果证明催化结构域活性高于全酶 ,是全酶活性的 2 .

关键词：人酪氨酸羟化酶催化结构域野生型酶融合蛋白表达酶活性

尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较

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第三军医大学学报 2014年第10期36卷 1055-1058页

作者：张雷曹宇亮刘明华第三军医大学西南医院急救部重庆400038

目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上... 详细信息

目的表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性。方法采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上,转入BL21(DE3)中表达,产物经亲和层析纯化。昆明小鼠随机分为催化结构域蛋白免疫组、非催化结构域蛋白免疫组、AaHⅣ免疫组、PBS免疫组,每组6只[4周龄,体质量(20±2)g,雌雄各半],3次免疫后分离血清,与AaHⅣ体外孵育后行出血中和实验。结果 ELISA显示重组表达的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域均具有免疫原性。出血中和实验显示:催化结构域免疫组和非催化结构域免疫组均较PBS免疫组显著减少出血面积(P催化结构域免疫组之间无统计学差异(P>0.05),而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异(P催化结构域免疫小鼠产生的抗体在中和AaHⅣ出血毒性方面效果更为显著。

关键词：尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶 SVMPs 催化结构域非催化结构域

猪MELK催化结构域的克隆表达及其与猪BCL-G共转染对细胞凋亡的影响

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猪MELK催化结构域的克隆表达及其与猪BCL-G共转染对细胞凋亡的影响

作者：刘艳国西北农林科技大学

学位级别：硕士

母系胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK),在鼠上叫做鼠源蛋白丝/苏氨酸激酶38(MPK38),在非洲爪蟾中也叫做pEg3,是细胞周期依赖蛋白激酶KIN1/PAR-1/MARK家族中的一个成员,在多种特异干细胞和癌细胞中高... 详细信息

母系胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal embryonic leucine zipper kinase,MELK),在鼠上叫做鼠源蛋白丝/苏氨酸激酶38(MPK38),在非洲爪蟾中也叫做pEg3,是细胞周期依赖蛋白激酶KIN1/PAR-1/MARK家族中的一个成员,在多种特异干细胞和癌细胞中高度表达。MELK广泛参与细胞的变化过程,其中包括细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡、剪接体组装、基因表达、胚胎发育、造血作用和肿瘤形成等。在乳腺癌细胞中MELK可以直接磷酸化BCL-GL,抑制BCL-GL介导的细胞凋亡作用。本实验室已克隆出猪MELK(pMELK)和猪BCL-G(pBCL-G),并通过免疫共沉淀和流式细胞术实验证明了pMELK能与pBCL-G发生相互作用,而后抑制pBCL-G的促凋亡作用。为研究pMELK催化结构域是否会抑制pBCL-G的促凋亡作用,本研究运用真核表达载体构建和流式细胞术等技术,来探究过表达pMELK催化结构域(catalytic domain,cd)对细胞凋亡的影响。研究结果如下:1.为获得稳定表达pBCL-G基因的细胞株,本实验对存放超过两年的细胞株进行表达稳定性检测。结果表明,pBCL-G基因能够持续稳定表达,为后续基因功能的研究奠定基础。2.本实验将pMELK的催化结构域连接到pCMV-HA真核表达载体,构建重组载体pCMV-HA-MELK-cd。采用脂质体法转染至猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)。48 h后收集细胞进行裂解,western blot检测融合蛋白pCMV-HA-MELK-cd的表达情况。3.我们将pCMV-HA空载体(阴性对照组)、pCMV-HA-pMELK-cd(实验组)和pCMV-HA-pMELK(阳性对照组)载体转染至稳定表达GFP-pBCL-G的SUVEC细胞中,分别用500 nM的STS诱导18 h后收集细胞,并进行流式细胞术检测。结果发现pMELK的催化结构域不能抑制pBCL-G的促凋亡作用。

关键词：猪MELK基因催化结构域真核表达细胞凋亡

以增加催化结构域的基因重构方法提高里氏木霉外切型葡聚糖酶Ⅱ的活性

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农业生物技术学报 2007年第6期15卷 1019-1023页

作者：邓丽瑜余少文邢苗张煜刘刚深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室深圳518060 深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室

通过两种增加催化结构域基因的方式对里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414外切型葡聚糖酶Ⅱ(CBHⅡ)编码基因(cbh2)进行重构。第一种重构方式是在cbh2基因的上游增加内切葡聚糖酶Ⅳ(EGⅣ)的催化结构域基因(cdE),第二种重构方式是在纤维素... 详细信息

通过两种增加催化结构域基因的方式对里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414外切型葡聚糖酶Ⅱ(CBHⅡ)编码基因(cbh2)进行重构。第一种重构方式是在cbh2基因的上游增加内切葡聚糖酶Ⅳ(EGⅣ)的催化结构域基因(cdE),第二种重构方式是在纤维素酶CBHⅡ编码基因的下游增加其自身的cdC基因。通过PCR和基因重构手段获得重组质粒pPICZαA-cdE-cbh2和pPICZαA-cbh2-cdC,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达,获得重组菌株***11和PCC16,在经改良的摇瓶培养条件下能表达具有较高CMCNa(sodium carboxymethyl cellulose)酶活性的融合蛋白,培养液的CMCNa活性分别达到3.87和7.66U/mL,其中*** PCC16表达的重构酶活性是毕赤酵母表达的单一CBHⅡ酶活性的2倍。表明采用增加结构域的方式可以有效地提高纤维素酶的活性。

关键词：里氏木霉催化结构域外切型葡聚糖酶Ⅱ 基因重构毕赤酵母

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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口腔医学研究 2003年第4期19卷 244-246页

作者：张凤秋杨连甲吴织芬金岩周鹏第四军医大学口腔医学院口腔内科陕西西安710032

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达... 详细信息

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白。

关键词：牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K 催化结构域基因克隆大肠杆菌

G蛋白偶联受体激酶-2的N端结构域缺失对其催化功能的影响

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生物化学与生物物理学报 1999年第6期31卷 648-652页

作者：甘肖箐王计勇杨齐衡郁庆明裴钢李林中国科学院上海生物化学研究所!上海20003 中国科学院上海细胞生物学研究所!上海200031 上海生命科学研究中心!上海200031

为揭示Ｇ蛋白偶联受体激酶（Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｓ，ＧＲＫｓ）的Ｎ端结构域在该酶家族磷酸化受体以及催化反应中的作用，对ＧＲＫ２的Ｎ端结构域进行了缺失突变研究。将Ｎ端结构... 详细信息

为揭示Ｇ蛋白偶联受体激酶（Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｓ，ＧＲＫｓ）的Ｎ端结构域在该酶家族磷酸化受体以及催化反应中的作用，对ＧＲＫ２的Ｎ端结构域进行了缺失突变研究。将Ｎ端结构域缺失的ＧＲＫ２（ΔＮＧＲＫ２）与谷胱甘肽转硫酶融合表达。经过亲和纯化后，再用凝血酶酶切得到单独的ΔＮＧＲＫ２蛋白。对磷酸化小肽的活力检测表明，Ｎ端结构域的缺失基本上不影响ＧＲＫ２的激酶催化活力。但ΔＮＧＲＫ２却完全丧失了对受体磷酸化的能力。此外，与野生型酶不同的是，ΔＮＧＲＫ２对小肽的催化活性不再受活化受体３２９ＧＲｈｏ＊和Ｇ蛋白βγ亚基的调节。以上结果表明，Ｎ端结构域是ＧＲＫ２对受体磷酸化所必需的，也是ＧＲＫ２受活化受体调节所必需的。可以推断，在天然状态下，ＧＲＫ２的中央催化结构域的结构可能并不受Ｎ端结构域的影响。

关键词： G蛋白偶联受体激酶-2 缺失突变 N端结构域催化结构域

Caldicellulosiruptor kronotskyensis 2002木聚糖内切酶的分子催化机理及结构域多态性

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Caldicellulosiruptor kronotskyensis 2002木聚糖内切酶的分子催...

作者：乔玮博沈阳农业大学

学位级别：硕士

极端嗜热菌微生物Caldicellulosiruptor kronotskyensis 2002可以将纤维素转化为氢和其他化学物质,并且能够直接利用含木聚糖的天然生物质。该菌中有多种多功能结构域木聚糖酶,并且具有催化结构域和非催化结构域多样性。其分属于GH10和G... 详细信息

极端嗜热菌微生物Caldicellulosiruptor kronotskyensis 2002可以将纤维素转化为氢和其他化学物质,并且能够直接利用含木聚糖的天然生物质。该菌中有多种多功能结构域木聚糖酶,并且具有催化结构域和非催化结构域多样性。其分属于GH10和GH11两个糖苷水解酶家族,许多还含有多种碳水化合物结合结构域CBM。木聚糖酶是降解木质生物质的关键酶,一般含有非催化结构模块CBM的木聚糖酶更容易与难降解多聚糖结合。了解多功能结构域木聚糖酶的结构组成及其功能,有助于工业酶的改造。为了探索C. kronotskyensis不同家族木聚糖酶水解木聚糖的机理,及CBM对木聚糖酶行使功能所起的作用,本研究首次从C. kronotskyensis中克隆了来自两种GH家族的β-1,4-内切木聚糖酶,并分别将它们及其截断体进行了异源重组表达和酶学性质分析。1.基因Calkro081编码一个新型的GH11木聚糖酶(Xyn11A),其包含1个催化域(GH-CD)和1个碳水化合物结合模块(CBM6)。本论文中对Xyn11A及其两个对应截断突变体Xyn11A-CD (Xyn11A的催化结构域)和Xyn11A-CBM (Xyn11A的碳水化合物结合结构域)进行了克隆、表达和生化性质分析。重组酶Xyn11A的最适反应温度为75℃,并在40-95℃具有较高的活性。Xyn11A在70℃下热处理6h内能保持稳定,在75℃下热孵育6h后酶活仍剩余50%以上。Xyn11A的最适pH为6.0,70℃下在pH 5.5～7.5的缓冲液中保存15h后仍能维持100%酶活。至于Xyn11A-CD,其最适pH和最适温度分别为6.0和65℃,60℃热处理6h后只剩余30%酶活。最适反应条件下,以榉木木聚糖(BWX)为底物,Xyn11A、Xyn11A-CD和Xyn11A-CBM的特异性酶活分别为1752.0、986.8和0 IU/mg。以BWX作为底物,经Xyn11A或Xyn11A-CD水解后最终产物主要是木糖和木二糖。CBM6在维持Xyn11A的热稳定性和高酶活力中扮演着重要的角色,因而高热稳定性和高温反应下的高酶活力使Xyn11A酶拥有工业应用潜力。***10A和Xyn10B分别为假定的胞外木聚糖酶和胞内木聚糖酶。Xyn10A和Xyn10B催化结构域的相似度为41%,前者包含1个串联的N-端CBM22s(CBM22-CBM22)。Xyn 1 OA对BWX和燕麦木聚糖(OSX)的水解能力要高于Xyn10B。就底物偏好性而言,Xyn10B更倾向于水解更小分子量的木寡糖。截断突变实验表明CBM对Xyn10A的活性、底物结合能力和热稳定性具有重要影响,而CBM的串联数量与酶分子的底物结合能力以及热稳定性无直接相关关系。与以往CBM是酶与底物至关重要的结合区域结论相反,Xyn10B、Xyn10A以及它们的截断突变体对不溶性底物OSX也表现出相似的底物亲和力。同时上述酶对微晶纤维素和天然底物也表现出轻微的吸附性。定点突变分析表明Xyn10A和Xyn10B具有相似的关键氨基酸残基：Xyn10A的Glu493、Glu601和Trp658,以及Xyn10B的Glu139、Glu247和Trp305均为这两种酶的关键活性位点。Xyn10A和Xyn10B能够作用于机械预处理的玉米芯、玉米秸秆和水稻秸秆,水解产物主要为低聚木糖和木糖。用Xyn10A或Xyn10B预处理天然生物质能使其更易于降解,同时与商业纤维素酶Cellic CTec2协同处理,大大提高了天然生物质的降解率。Xyn10A与商业纤维素酶协同作用于天然玉米芯,葡萄糖产量提高约24.7%,木糖产量提高约62.6%。Xyn10B与商业纤维素酶协同作用于天然玉米芯,葡萄糖产量提高约32.8%,木糖产量提高约58.0%。这些都表明Xyn10A和Xyn10B在改善生物质转化率和降低生物炼制过程中生物质的预处理强度等方面具有广泛的应用前景。

关键词： Caldicellulosiruptor kronotskyensis 木聚糖内切酶催化结构域底物结合结构域结构域多样性