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植物保护学报 2023年第5期50卷 1137-1149页

作者：丁善文马紫君蓝国兵汤亚飞何自福佘小漫广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广州510640

为丰富假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum基因组数据库并探索其致病机理,以前期从南瓜上分离的菌株RSCM为研究对象,采用第二代Illumina平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术对其进行全基因组测序,利用SMRT Link、Arrow和eg... 详细信息

为丰富假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum基因组数据库并探索其致病机理,以前期从南瓜上分离的菌株RSCM为研究对象,采用第二代Illumina平台与第三代PacBio平台相结合的测序技术对其进行全基因组测序,利用SMRT Link、Arrow和eggNOG等软件对测序得到的原始数据进行组装、拼接和注释,并通过比较基因组方法分析其与菌株GMI1000的差异。结果表明,菌株RSCM基因组大小约为6000712 bp,由3788542 bp的环形染色体和2212170 bp的环形宏质粒组成,含有5047个编码基因,其中分别有3579、4240、3171个基因获得GO、COG和KEGG数据库的注释;在菌株RSCM基因组中预测到58个tRNA、4个5S rRNA、4个16S rRNA、4个23S r RNA和4个ncRNA,含有5个前噬菌体序列和35个基因组岛。ANI分析发现研究对象与菌株GMI1000的亲缘性最近,ANI值为99.0%;基因组对比分析结果显示,与菌株GMI1000相比,菌株RSCM中存在易位、倒置、易位兼倒置的基因有571个;缺失1个Ⅱ型分泌系统的基因簇Cluster-3;且包含RipS8、RipAL、RipAP、RipAT、RipBA、RipBE、RipBM和RS_T3E_Hyp14八个特有的Ⅲ型效应蛋白。对RipBA效应蛋白进行鉴定分析,发现其具有1个糖基化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和2个豆蔻酰化位点;RT-qPCR检测发现,在菌株RSCM侵染寄主过程中RipBA基因显著上调表达。表明菌株RSCM与菌株GMI1000的基因组存在差异,推测其可能与假茄科雷尔氏菌的寄主适应性和致病性有关。

关键词：假茄科雷尔氏菌全基因组测序比较基因组分析特异基因

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假茄科雷尔氏菌引起向日葵青枯病在中国的首次报道

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植物保护 2023年第2期49卷 243-249页

作者：佘小漫李萍蓝国兵于琳李正刚汤亚飞何自福广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科... 详细信息

茄科雷尔氏菌复合种侵染引起的青枯病是众多作物上的毁灭性病害。2020年笔者首次在广东省东莞市发现向日葵青枯病,并对其病原菌进行了鉴定。室内人工接种试验、16S rDNA序列比对和演化型鉴定结果表明,引起向日葵青枯病的病原菌为假茄科雷尔氏菌Ralstonia pseudosolanacearum。生理生化特性和致病性鉴定结果表明,分离自向日葵的15株假茄科雷尔氏菌为1号生理小种和生化变种3。egl基因部分序列系统进化分析表明,15株假茄科雷尔氏菌分属4个序列变种,其中8株菌株为序列变种17,5株菌株为序列变种13,其余2株菌株分别为序列变种14和序列变种54。本文是我国首次报道假茄科雷尔氏菌侵染引起向日葵青枯病。

关键词：向日葵假茄科雷尔氏菌致病性分子鉴定序列变种

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假茄科雷尔氏菌对瓜类作物的致病性以及南瓜响应病菌侵染的转录组和代谢组分析

假茄科雷尔氏菌对瓜类作物的致病性以及南瓜响应病菌侵染的转录组...

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作者：何永林广西大学

学位级别：硕士

青枯菌复合种(Ralstonia solanacearum species complex,RSSC)具有丰富的寄主多样性,其中假茄科雷尔氏菌(***)分布范围最广,引起的植物青枯病往往造成巨大的经济损失。近年来,葫芦科作物青枯病在我国少数区域有逐步发生严重的趋势,但关... 详细信息

青枯菌复合种(Ralstonia solanacearum species complex,RSSC)具有丰富的寄主多样性,其中假茄科雷尔氏菌(***)分布范围最广,引起的植物青枯病往往造成巨大的经济损失。近年来,葫芦科作物青枯病在我国少数区域有逐步发生严重的趋势,但关于不同寄主来源青枯菌菌株对葫芦科植物及其他科植物的致病性情况不清楚,葫芦科植物抵抗不同致病性菌株侵染的机理尚不明确,难以制定有效的防治葫芦科作物青枯病的措施。为此,本研究在前期研究工作已明确南瓜、丝瓜和苦瓜等葫芦科作物均可发生青枯病的基础上,以22株不同寄主来源的假茄科雷尔氏菌菌株为研究材料,测定其对南瓜、丝瓜和苦瓜的致病性,并鉴定其生理小种类型,从中筛选出对南瓜具有致病性差异的菌株,对接种后南瓜植株防御相关的生理生化性状以及转录组和代谢组进行分析,以期揭示南瓜对不同致病性菌株侵染的抗性机理。主要研究结果如下:1、测定不同寄主来源的22株菌株对南瓜、丝瓜和苦瓜的致病性结果发现,源自葫芦科的菌株(Cq01、Bg07、Tg03)以及四季豆的菌株(Kb01)对这三种瓜具有强致病力,源自烟草、花生和辣椒上的5株菌株具有弱致病力,但大部分源自非葫芦科的菌株对三种瓜无致病性。以青枯菌模式菌株GMI1000(生理小种1号)灌根接种8种植物为参照,测定16株代表菌株的生理小种,发现这些菌株均为生理小种1号。采用伤根灌菌和注射菌液的方法将5株菌株不同浓度的菌液接种到南瓜植株上,筛选出对南瓜具有强致病力的菌株Cq01和无致病性菌株GMI1000;两者接种南瓜1 d后,南瓜根系内部均检测到病菌;南瓜接种Cq01菌株5 d的植株发病率为30.56%,接种7 d后的植株发病率高达77.78%,而接种GMI1000菌株的南瓜植株一直未发病。2、Cq01和GMI1000菌株均能诱发南瓜产生活性氧和过敏性坏死反应,前者诱导程度更为强烈;Cq01菌株在侵染早期到发病中期均能显著提高南瓜植株的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)的酶活性,并能促进丙二醛(MAD)产生;GMI1000菌株也能显著增强南瓜植株的POD活性,但显著低于Cq01处理;GMI1000菌株只能在侵染早期增强南瓜植株的PAL、SOD和PPO的活性,不能促进MAD的产生。结果表明,南瓜接种病原菌后,植株体内的PAL、POD、SOD和PPO酶活性以及MAD含量与接种病菌的毒力强弱有关。3、南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组分析结果发现,Cq01菌株接种的南瓜植株有146个差异基因,上调110个。差异基因的GO注释主要富集在乙烯激活信号通路、茉莉酸介导的信号通路、细菌防御反应、水杨酸响应和果胶分解代谢过程等方面;KEGG注释主要富集在与植物细胞壁降解相关的果胶裂解酶,与信号转导相关的钙结合蛋白和乙烯反应转录因子,与抗病相关的RPM1互作蛋白4、MYB转录因子和EREBP转录因子以及与氨基酸合成相关的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。GMI100菌株接种的南瓜植株有53个差异基因,上调49个。差异基因的GO注释主要富集在硝酸盐同化、寡肽运输、硝酸盐转运和植物型细胞壁组织等方面;KEGG注释主要富集在病程蛋白相关蛋白,与苯丙烷生物合成相关的肉桂醇脱氢酶和β-葡萄糖苷酶,与抗氧化相关的谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽,与能量代谢相关的果糖-1,6-二磷酸酶,与氮素代谢相关的硝酸盐/亚硝酸盐转运体等。分别选取Cq01和GMI1000与寄主互作途径的8个基因进行q RT-PCR验证,结果与转录组测序结果基本一致。4、南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的代谢组分析结果发现,接种Cq01菌株的南瓜植株有3个上调差异代谢物(鸟氨酸、苏糖酸和D-赤酮酸内酯);接种GMI1000菌株的南瓜植株有3个差异代谢物,上调1个(葡萄糖酸),下调2个(1,3-丙二胺和棉子糖)。南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组和代谢组关联分析结果发现,南瓜响应Cq01菌株侵染的最密切的代谢途径是精氨酸生物合成途径,南瓜响应GMI1000菌株侵染最密切的代谢途径是戊糖磷酸途径。综上所述,源自葫芦科的菌株和少数非葫芦科的菌株对瓜类作物具有致病性,而大部分源自非葫芦科的菌株则表现无致病性;Cq01菌株侵染南瓜植株诱导防御相关的生理生化反应比GMI1000菌株侵染南瓜诱导的反应更为强烈;据南瓜响应Cq01和GMI1000菌株侵染的转录组和代谢组关联分析结果推测,南瓜受到Cq01菌株侵染后,植株体内经过精氨酸生物合成途径产生对植株自身有毒性作用的鸟氨酸代谢物,降低植株对青枯病的抗性,从而导致植株发病。GMI1000菌株可诱导南瓜植株体内增强戊糖磷酸途径产生抗病物质,抑制病菌在植株体内

关键词：假茄科雷尔氏菌南瓜致病性转录组代谢组

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福建猕猴桃细菌性枯萎病的病原菌鉴定

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中国农业科技导报 2024年第4期26卷 144-152页

作者：季梦婷陈长江罗流河林志坚詹梦琳杨丙烨胡方平蔡学清福建农林大学植物保护学院福州350002 福建农林大学计算机与信息学院福州350002

为明确近年来在福建省宁德市蕉城区石后乡猕猴桃苗圃新发生的一种细菌性病害病的原菌,并进一步探讨其发生流行规律,采用稀释分离法对采集病株进行病原菌的分离和纯化,对获得的细菌菌株进行致病性测定,通过柯赫氏法则验证、常规的细菌生... 详细信息

为明确近年来在福建省宁德市蕉城区石后乡猕猴桃苗圃新发生的一种细菌性病害病的原菌,并进一步探讨其发生流行规律,采用稀释分离法对采集病株进行病原菌的分离和纯化,对获得的细菌菌株进行致病性测定,通过柯赫氏法则验证、常规的细菌生物学特性、生理生化反应、Biolog鉴定、16S rDNA和内切葡聚糖酶基因(egl)序列分析对病原菌进行分类鉴定。结果表明,从发病猕猴桃病株上获得9株细菌菌株,将其接种在健康的猕猴桃植株后,其发病症状与田间自然发病症状基本一致,且从接种后病株的茎秆和根部又重新分离到与原菌落形态相同的细菌。柯赫氏法则证实这9株细菌菌株为猕猴桃细菌性枯萎病的致病菌。这9株菌株在NA培养基上的菌落形态一致,均呈不规则型、扁平,并逐渐向四周扩散,不产生粘稠状物质,不会使培养基变色;在TTC培养基上,菌落颜色呈暗红色,产生可扩散至培养基中的红褐色色素,其流动性较差;在YDC培养基上,菌落呈乳白色。经综合分析,这9株细菌菌株均被鉴定为假茄科雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum),生化型Ⅲ和演化型Ⅰ(亚洲组),序列变种14。这是首例青枯菌侵染猕猴桃的报道。以上研究结果为制定猕猴桃细菌性枯萎病精准有效的综合防控提供了理论依据。

关键词：猕猴桃细菌性枯萎病病原菌鉴定生理生化测定假茄科雷尔氏菌 16S rDNA

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福建仙草细菌性枯萎病的病原菌鉴定

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亚热带农业研究 2022年第4期18卷 267-273页

作者：吴水良林可竟张一帆詹梦琳胡方平蔡学清福建农林大学植物保护学院福建福州350002

[目的]明确新发现的福建省龙岩市武平县仙草(Mesona chinensis)细菌性枯萎病的病原,为该病害的有效防控提供依据。[方法]采用平板分离法对采集的病株进行病原菌分离、纯化,通过柯赫氏法则验证其致病性。通过常规的生物学特性、特异性引... 详细信息

[目的]明确新发现的福建省龙岩市武平县仙草(Mesona chinensis)细菌性枯萎病的病原,为该病害的有效防控提供依据。[方法]采用平板分离法对采集的病株进行病原菌分离、纯化,通过柯赫氏法则验证其致病性。通过常规的生物学特性、特异性引物扩增及16S rDNA序列分析,鉴定病原菌的分类。[结果]从病茎上分离纯化获得8株细菌菌株,接种到健康的仙草后所表现的发病症状与田间采集的症状相类似,且重新分离到与原菌落形态相同的细菌。柯赫氏法则证实,8株细菌菌株均为该病的致病菌。在NA培养基平板上细菌菌落为乳白色,在TTC培养基平板上菌落为暗红色,产生可扩散至培养基中的红褐色色素;细菌革兰氏染色阴性,菌体短杆状,两端圆,1~2根极生鞭毛;菌株可积累聚-β-羟基丁酸盐(PHB),41℃不生长,果胶酶、氧化酶和硝酸盐还原等为阳性;菌株均可利用3种双糖(乳糖、麦芽糖、纤维二糖)和3种己醇(甘露醇、山梨醇、甜醇);用青枯菌演化型复合引物扩增分别获得280、144 bp的目的条带,16S rDNA基因序列分析结果显示,菌株与Ralstonia pseudosolanacearum聚在一支。鉴于此,将分离获得的8株细菌菌株鉴定为假茄科雷尔氏菌(***)。[结论]引起福建省龙岩市武平县仙草细菌性枯萎病的病原菌为假茄科雷尔氏菌,生化型Ⅲ和演化型Ⅰ(亚洲组)。

关键词：细菌性枯萎病仙草假茄科雷尔氏菌病原鉴定 16S rDNA

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嫁接节瓜青枯病的病原菌分化及其侵染动态分析

嫁接节瓜青枯病的病原菌分化及其侵染动态分析

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作者：张耀文广西大学

学位级别：硕士

近年来陆续报道了葫芦科不同种的植物上发生了青枯病,但有关病害的病原特性及其致病机制尚不清楚,难以制定有效的防控措施。本研究的前期工作发现,从以南瓜为砧木的嫁接节瓜中分离的青枯菌(简称嫁接节瓜青枯菌)对南瓜和以南瓜为砧木的... 详细信息

近年来陆续报道了葫芦科不同种的植物上发生了青枯病,但有关病害的病原特性及其致病机制尚不清楚,难以制定有效的防控措施。本研究的前期工作发现,从以南瓜为砧木的嫁接节瓜中分离的青枯菌(简称嫁接节瓜青枯菌)对南瓜和以南瓜为砧木的嫁接节瓜有较强的致病力,而对节瓜实生苗的致病力较弱;青枯菌标准菌株GMI1000虽与葫芦科植物分离的青枯菌菌株均属演化型I、1号生理小种,但对葫芦科植物不致病。为探明嫁接节瓜青枯菌的不同菌株的致病力分化以及与GMI1000菌株的致病性差异,本研究测定嫁接节瓜青枯菌不同菌株对南瓜和节瓜实生苗的致病力,对嫁接节瓜青枯菌Cq01菌株进行了比较基因组分析,检测了Cq01和GMI1000菌株在南瓜上的侵染动态,并在南瓜次生代谢产物(作为寄主信号)诱导下,比较两株菌株与致病相关的生理生化反应差异,获得的主要结果如下:(1)从广西南宁市五塘镇嫁接节瓜青枯病标样及附近发病的苦瓜、辣椒和花生植株中分离得到的菌株均属于演化型I,即假茄科雷尔氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)。除花生青枯菌为序列变种44外,其他菌株属于序列变种13。嫁接节瓜青枯菌Cq01和Cq03菌株对10个节瓜品种都具有致病性,但致病力弱;10株嫁接节瓜青枯菌菌株对南瓜砧木的致病力有明显差异,病情指数为7～94;对节瓜实生苗的致病力较弱(病情指数低于31),但存在差异。(2)应用高通量测序技术,完成Cq01菌株及其他9株不同作物青枯菌菌株(其中4株对葫芦科植物致病,5株不致病)的基因组测定。其中,Cq01菌株基因组全长为5,882,659 bp,GC含量67.72%,共编码5,144个基因。比较基因组分析发现,葫芦科植物致病菌株中的核心基因占泛基因的比值与非致病菌株中的比值接近,但两种致病类型所有菌株的核心基因占泛基因的比值与单独某一致病类型菌株相比下降大于10%。与非致病类型菌株相比,在所有供试致病菌株中没有发现仅仅它们共有的基因和共同缺失的基因。基因组系统发育分析显示,来自南宁市五塘且对南瓜致病的菌株亲缘关系较为接近,其他不同致病类型的菌株的亲缘关系与寄主或地理来缘无明显关联。(3)用绿色荧光基因gfp标记的Cq01和GMI1000菌株接种南瓜根部,1 d后Cq01入侵根部维管束,2～3 d进入子叶下方茎部,此时南瓜开始表现萎蔫症状。接种的第4 d,Cq01侵入南瓜子叶上部茎,植株进入发病高峰期。对于GMI1000菌株,仅观察到其侵入南瓜根毛,植株表现健康。采用稀释涂板法定量分析各个部位菌量,当根部菌量达到10CFU/g时,植株出现萎蔫症状;当茎部菌量达到10CFU/g时,整株萎蔫。而GMI1000菌株侵染的植株的根部菌量最高仅为10CFU/g。当采用茎部注射法接种时,注射部位的Cq01和GMI1000菌株的菌量持续增长,第5 d达到最高值,约10CFU/g。Cq01菌株可以从注射部位向上、下扩展,接种第3 d显症,而GMI1000菌株在植株内的扩展受限,不能致使植株发病。(4)在南瓜苗提取物诱导作用下,Cq01和GMI1000菌株的趋化性和胞外多糖产量未受影响,虽然两株菌株的运动性都有所增强,但Cq01菌株的运动性强于GMI1000菌株;Cq01和GMI1000菌株生物膜形成都有显著增加,且低浓度提取物就对GMI1000菌株的生物膜形成产生明显的促进作用;低浓度(12.5和6.25μg/m L)的南瓜苗提取物对两株菌株的纤维素酶和果胶酶活性无影响,当浓度达到25μg/m L时,GMI1000菌株的果胶酶活性有所增强。综上所述,以南瓜为砧木的嫁接节瓜青枯菌对节瓜实生苗致病力弱,对南瓜致病力强,不同菌株间存在致病力分化;与葫芦科植物非致病菌株基因组比较,致病菌株基因组中没有发现特有基因;嫁接节瓜青枯菌菌株Cq01可迅速侵染南瓜并在植株体内大量繁殖和扩展,而GMI1000菌株侵入植株中的数量较低,扩展受限,但其在南瓜苗提取物作用下的众多致病因子未受抑制。该研究对深入研究嫁接节瓜青枯菌的地理起源、寄主特异性及其致病机制提供了一定参考,为作物抗青枯病育种和防治研究打下基础。

关键词：嫁接节瓜青枯病假茄科雷尔氏菌南瓜砧木病原菌分化侵染动态

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蒲桃雷尔氏菌（Ralstonia syzygii）LLRS-1的基因组学分析

蒲桃雷尔氏菌（Ralstonia syzygii）LLRS-1的基因组学分析

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中国植物病理学会2021年学术年会

作者：卢灿华李军营米梦鸽马俊红姜宁盖晓彤雷丽萍晋艳夏振远云南省烟草农业科学研究院天津农学院园艺园林学院

青枯病是重要的烟草病害。近年来,该病在云南省的文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等州（市）普遍发生,其中文山、临沧、保山和德宏的部分地区发病较为严重。虽然烟草青枯病在云南省发病较为严... 详细信息

青枯病是重要的烟草病害。近年来,该病在云南省的文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等州（市）普遍发生,其中文山、临沧、保山和德宏的部分地区发病较为严重。虽然烟草青枯病在云南省发病较为严重,但对该病的研究相对不足,尤其在病原学方面的研究尚少。为系统研究该病原菌的遗传多样性,笔者在云南省的13个植烟州（市）开展疑似青枯病病样的采集与分离鉴定,其间从云南省玉溪市分离获得1株青枯菌LLRS-1。经16S rDNA序列分析,发现其与蒲桃雷尔氏菌（Ralstonia syzygii）一致性最高,复合PCR检测结果表明该菌属于演化型Ⅳ菌株。已知的烟草青枯菌有茄科雷尔氏菌（***）、假茄科雷尔氏菌（***）,但未见蒲桃雷尔氏菌侵染引起烟草青枯病的报道。为进一步明确LLRS-1的分类地位,本文对其进行全基因组测序。测序共获得3 952 586个读长,产生488 Mb数据,测序深度为85x。数据组装后形成2个复制单元,共5 694 719 bp,其中染色体为3 648 314 bp,巨型质粒为2 046 405 bp,总GC含量为67.05%。基因组含5 190个蛋白编码的基因,55个tRNA基因,28个sRNA基因,3套rRNA结构基因（5S-15S-23S）。运用EzBioCloud数据库分析雷尔氏菌内各个亚种的标准菌株与LLRS-1的平均核苷酸一致性（ANI）,结果表明LLRS-1与蒲桃雷尔氏菌（***）的三株菌的ANI均大于96%。进一步分析表明,菌株LLRS-1与3株蒲桃雷尔氏菌的DNA-DNA杂交值（isDDH）均大于亚种划分的临界范围79%～80%;基于基因组序列构建的系统发育树表明LLRS-1与蒲桃雷尔氏菌印度尼西亚亚种（*** ***）标准菌株PSI7T亲缘关系最近。蒲桃雷尔氏菌在印度尼西亚引起香蕉、丁香和其他作物的青枯病,本研究属首次在烟草上报道其引起青枯病。

关键词：烟草青枯病病原菌茄科雷尔氏菌假茄科雷尔氏菌蒲桃雷尔氏菌

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