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作者：顾顺利中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

血小板是从骨髓成熟巨核细胞脱落下来的小块胞质,其主要功能为止凝血,但在抗细菌感染方面也发挥着重要作用。血小板输注是临床治疗中不可替代的重要方法之一,对于创伤出血、血液系统疾病及败血症患者来说,及时输注血小板不仅可以改善预... 详细信息

血小板是从骨髓成熟巨核细胞脱落下来的小块胞质,其主要功能为止凝血,但在抗细菌感染方面也发挥着重要作用。血小板输注是临床治疗中不可替代的重要方法之一,对于创伤出血、血液系统疾病及败血症患者来说,及时输注血小板不仅可以改善预后,甚至可以挽救患者生命。近年来,随着住院人数的不断增加,血小板的需求缺口越来越大,供不应求已成常态。虽然影响血小板供需矛盾的原因有很多,但血小板的体外保存期过短是其主要因素之一。如果采集量小则不能满足临床需求;而如果大量采集,有效期内没有被使用就必须报废处理。近年研究发现,4℃冷藏可以将血小板的体外保存期从5天延长至14天以上,该方法可以有效解决血小板的供需矛盾问题。但是,在延长体外保存期的同时,4℃冷藏条件会诱导血小板发生冷藏损伤,具体表现在胞内游离钙离子浓度([Ca])的升高、骨架蛋白的受损以及细胞形态的不规则改变等,严重制约着4℃冷藏血小板的大规模临床应用。不仅如此,冷藏损伤是否影响血小板的抗菌功能未见研究和报道。本研究以4℃冷藏血小板作为研究对象,探讨4℃冷藏条件对血小板的损伤作用及其相关机理,为避免或降低血小板的4℃冷藏损伤提供新的理论和实验依据;然后进一步选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)作为实验细菌,重点探讨22℃保存血小板的抗MRSA功能和4℃冷藏血小板的抗MRSA功效,主要研究内容包括:1.4℃冷藏条件对血小板的损伤作用研究取适量去白细胞单采血小板进行纯化处理,将纯化血小板分别在22℃和4℃保存48小时后37℃孵育1小时。扫描电镜结果显示,22℃保存血小板的细胞膜结构完整,形态规则呈圆形;而4℃冷藏血小板的细胞膜上有小孔出现,细胞形态不规则,有大量伪足伸出。流式细胞术结果显示4℃冷藏血小板的平均细胞膜荧光强度降低。免疫印迹(Western Blot,WB)证实其微管蛋白β3减少。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)结果显示4℃冷藏血小板上清中的血小板因子4(platelet factor 4,PF4)和五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)显著升高。这些结果说明4℃冷藏环境可能损伤血小板的细胞结构,特别是细胞膜。2.4℃冷藏条件对血小板的损伤机理探讨取适量纯化血小板,分别在22℃和4℃保存48小时后37℃孵育1小时,进行流式细胞术检测。结果显示,实验组的胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和[Ca]升高。该结果提示4℃冷藏血小板的细胞损伤可能与胞内ROS水平以及[Ca]的升高有关。取适量纯化血小板,分别用ROS中和剂维生素C(vitamin c,Vc)和等体积PBS预处理,4℃保存48小时后37℃孵育1小时。流式细胞术结果显示Vc组细胞膜的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)升高。WB结果显示Vc组的微管蛋白β3浓度升高。ELISA结果显示Vc组上清中的PF4和5-HT浓度降低。这些结果进一步说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能与胞内ROS水平的升高有关。取适量纯化血小板,分别应用胞内钙离子螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N`,N`-四乙酸四乙酸甲酯(1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N,N-tetraacetic acid acetoxymethy,BAPTA-AM)和等体积PBS预处理,4℃保存48小时后37℃孵育1小时。流式细胞术结果显示BAPTA-AM组的胞内ROS水平降低且细胞膜的MFI升高。WB结果显示BAPTA-AM组的微管蛋白β3浓度显著增加。ELISA结果显示BAPTA-AM组上清中的PF4和5-HT浓度降低。这些结果说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能是由升高的[Ca]诱导胞内ROS过量生成引起。取适量纯化血小板,分别进行WB、免疫荧光和免疫电镜检测。结果显示血小板上存在瞬时受体电位锚蛋白-1(transient receptor potential anchor protein-1,TRPA1),且定位在血小板胞内的内质网、致密颗粒及α颗粒的膜上。进一步分别应用TRPA1的选择性激动剂异硫氰酸丙酯(propyl isothiocyanate,AITC)和等体积PBS预处理血小板。流式细胞术结果显示AITC组的胞内ROS水平和[Ca]显著升高;而细胞膜的MFI显著降低。WB结果显示AITC组的微管蛋白β3浓度显著降低。BAC法蛋白浓度检测结果显示AITC组上清中的蛋白浓度显著升高。这些结果说明4℃冷藏血小板的细胞损伤可能是由TRPA1介导的[Ca]升高并进一步诱导ROS的过量生

关键词：冷藏血小板保存损伤 ROS 胞内游离钙离子 TRPA1 MRSA

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NO与红细胞保存损伤研究进展

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现代检验医学杂志 2012年第5期27卷 3-5页

作者：王文婷穆士杰张献清第四军医大学西京医院输血科西安710032

血液输注已成为现代医疗救治过程中非常重要的环节之一，尤其是红细胞的输注。在各种血液病、慢性失血、慢性贫血等患者救治过程中，红细胞输注可有效纠正贫血和改善机体携氧状况，提高机体循环代谢功能。

关键词：红细胞一氧化氮保存损伤

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血小板保存损伤的研究进展

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中国输血杂志 2002年第1期15卷 65-67页

作者：吕俊海刘明东韩颖军事医学科学院野战输血研究所北京100850

血小板保存损伤(storage lesion)是指在保存过程中血小板出现的一系列的形态、功能和代谢上的改变.尽管血小板的保存研究已有几十年的历史,但是迄今为止,血小板的有效保存时间仅为5d.其原因在于保存过程中,血小板的损伤机制十分复杂,涉... 详细信息

血小板保存损伤(storage lesion)是指在保存过程中血小板出现的一系列的形态、功能和代谢上的改变.尽管血小板的保存研究已有几十年的历史,但是迄今为止,血小板的有效保存时间仅为5d.其原因在于保存过程中,血小板的损伤机制十分复杂,涉及到多个方面,笔者现综述这方面的研究进展.

关键词：血小板保存损伤研究进展损伤机制检测标志

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冷藏血小板保存损伤机理的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2006年第5期29卷 455-458页

作者：曹帆帆谢如锋高峰华东师范大学生命科学学院2004级上海市血液中心血液工程研究室上海研究生200062

目前,血小板一般以22℃振荡保存为标准方法。但是,这种方法存在血小板制品污染的风险,使得血小板的保存期仅仅只有5d。探索血小板4℃低温保存已成为一项非常有意义的课题。本文对血小板冷藏保存损伤机理的研究进展作一综述。

关键词：血小板冷藏保存损伤

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红细胞保存损伤及其对策

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临床输血与检验 2013年第2期15卷 187-190页

作者：唐会珍陈海珊张献清第四军医大学西京医院输血科西安710032 解放军201医院

红细胞保存损伤是指血液保存在液体基质中红细胞发生的生物化学与形态学上的改变,红细胞保存损伤是影响红细胞保存效期和临床输血效果的一个重要因素,本文就红细胞保存损伤的主要机制及对策进行综述。

关键词：输血红细胞保存损伤

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乳酸脱氢酶测定对评估机采单个供者血小板保存中损伤的价值

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临床军医杂志 2006年第1期34卷 75-76页

作者：李大鹏徐学芳任红冯永军武琴孙恩斌解放军第88医院输血科解放军山东泰山军分区山东泰安271000 解放军第81医院江苏南京210002

目的探讨测定LDH作为保存SDP的损伤评价标准的价值。方法选择19份SDP样本均分为2组，放置于血小板摇床内保存，保存24h为实验组，保存1-3h为对照组，检测并比较2组间LDH值。结果 SDP保存24h后与1-3h的LDH值存在显著性差异。结论选择... 详细信息

目的探讨测定LDH作为保存SDP的损伤评价标准的价值。方法选择19份SDP样本均分为2组，放置于血小板摇床内保存，保存24h为实验组，保存1-3h为对照组，检测并比较2组间LDH值。结果 SDP保存24h后与1-3h的LDH值存在显著性差异。结论选择悬浮SDP血浆检测LDH水平可评估保存SDP损伤。

关键词：机采血小板单个供者保存损伤乳酸脱氢酶

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微小RNA作为单采血小板储存损伤标志物不同保存期的差异表达谱

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临床血液学杂志 2023年第2期36卷 91-94页

作者：石洁艾俊徐安琪贾璐陈津南京红十字血液中心南京210003

目的:探讨单采血小板不同保存期微小RNA(mRNA)表达谱差异,发现由于储存过程中血小板生物学变化引起的新的敏感性表达miRNA。方法:通过新一代small RNA测序技术结合生物信息学分析方法,筛选出单采血小板在体外保存期间存在差异表达的miR... 详细信息

目的:探讨单采血小板不同保存期微小RNA(mRNA)表达谱差异,发现由于储存过程中血小板生物学变化引起的新的敏感性表达miRNA。方法:通过新一代small RNA测序技术结合生物信息学分析方法,筛选出单采血小板在体外保存期间存在差异表达的miRNA,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证。结果:miRNA表达谱芯片结果显示6组不同保存期单采血小板普遍高表达hsa-let-7家族,hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-199,hsa-miR-103a-3p。时间序列分析对944个差异表达miRNA进行趋势分类,共发现44个基因呈现14种趋势变化。以保存第1天为对照组,hsa-miR-4433b-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-30c-5p显著下降。结论:分析筛选出表达差异的miRNA-30c-5p, miRNA-22-3p, miRNA-4433b-5p为下一步研究单采血小板储存损伤标志物奠定基础。

关键词：单采血小板保存损伤 miRNA qRT-PCR

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不同温度及时间对保存血液有效期和质量的影响

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中国应用生理学杂志 2002年第4期18卷 362-364页

作者：杜静平邢天荣马奎力邢凤有佳木斯大学医学院病理生理教研室黑龙江佳木斯154002

目的 :研究不同温度对血液液状保存时保存损伤机制的影响 ,并探讨相应的防范措施。方法 :取 10名健康献血员静脉血 ,混合于CP2D A保存液中 ,均分为 2组 ,分别保存于 0℃和 4℃环境条件下 ,分别于设定的时间 (第2 1d和第 4 2d)以shafiq U... 详细信息

目的 :研究不同温度对血液液状保存时保存损伤机制的影响 ,并探讨相应的防范措施。方法 :取 10名健康献血员静脉血 ,混合于CP2D A保存液中 ,均分为 2组 ,分别保存于 0℃和 4℃环境条件下 ,分别于设定的时间 (第2 1d和第 4 2d)以shafiq UR rehman法检测膜磷脂 ,同步法检测Na+ K+ ATP酶、纯化PDE法检测CaM、分光光度法检测LPO等指标。结果 :固定温度条件下随时间的延长血液过氧化反应增强 ,保存损伤作用增加 ;同一时期内保存损伤作用随温度的降低而减轻 ,以 4℃组血液老化明显。结论 :血液保存损伤作用随保存期的延长而增强 ,随保存温度的降低而改善 ,并指出血液液状保存所存在的问题与展望。

关键词：温度时间保存血液有效期质量血流保存保存损伤

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人工冬虫夏草菌粉提高大鼠肝脏保存质量的实验研究

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西安交通大学学报（医学版） 2005年第2期26卷 135-138页

作者：方铁李龙张金哲张清秀首都医科大学附属北京三博复兴脑科医院神经外科北京大学附属妇女儿童医院首都医科大学附属北京儿童医院北京100045

目的　探讨人工冬虫夏草菌粉提取液对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用。方法　将一定剂量的虫草提取液加入乳酸林格液内,分别低温保存大鼠肝脏6、12 h后,再灌注30 min。通过高压液相色谱法(HPLC)检测肝脏组织内的ATP、ADP、AMP含量,测... 详细信息

目的　探讨人工冬虫夏草菌粉提取液对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用。方法　将一定剂量的虫草提取液加入乳酸林格液内,分别低温保存大鼠肝脏6、12 h后,再灌注30 min。通过高压液相色谱法(HPLC)检测肝脏组织内的ATP、ADP、AMP含量,测定再灌注流出液内的AST、ALT、MDA及ET含量。并切取肝脏标本,光镜及电镜观察肝组织损伤情况。结果　于保存6 h后,实验组AST、ALT、MDA和ET均低于对照组,但无统计学显著差异(P>0.05)。光镜下除轻度细胞水肿外,无其他明显病理改变;保存12 h后,实验组流出液ALT、MDA及ET含量明显低于对照组(P保存肝脏的质量。

关键词：保存损伤冬虫夏草细胞凋亡 HPLC TUNEL

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移植肝急性细胞性排斥反应和巨细胞病毒感染的临床病理研究

移植肝急性细胞性排斥反应和巨细胞病毒感染的临床病理研究

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作者：程龙第三军医大学

学位级别：硕士

近年来,肝移植(liver transplantation, LT)在国内蓬勃发展,成为治疗各种终末期肝病的首要选择。随着外科技术的发展和新型有效免疫抑制剂的应用,术后并发症的诊断和处理逐渐成为决定患者远期预后的关键。急性细胞性排斥反应(acute cell... 详细信息

近年来,肝移植(liver transplantation, LT)在国内蓬勃发展,成为治疗各种终末期肝病的首要选择。随着外科技术的发展和新型有效免疫抑制剂的应用,术后并发症的诊断和处理逐渐成为决定患者远期预后的关键。急性细胞性排斥反应(acute cellular rejection, ACR)是LT术后发病率最高的并发症,其病理诊断和与其他并发症的鉴别诊断是移植肝病理学的重点和难点。巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染是LT术后最常见机会性感染,发病隐匿,临床表现不特异,缺乏有效的病毒检测方法,且它与ACR的治疗方法截然相反,因此两者的鉴别诊断亦非常重要。本课题通过对234例LT患者临床病理分析,以探讨ACR的病理形态特点以及术中零时相活检组织学改变与术后并发症发生的关系,并对晚期活检病例进行HBsAg及HBcAg检测,提出晚期急性排斥反应(LAR)与乙肝复发或再感染的鉴别要点。应用CD8、CD4、CD3、CD20、CD45RO、CD45RA、Perforin、GranzymeB及TIA-1单抗对108例次移植肝活检组织进行免疫组化染色,分析不同区域浸润淋巴细胞的免疫表型及细胞毒性蛋白的表达情况,探讨ACR的发生机制,提出ACR的辅助诊断指标。同时对25例CMV感染和25例无CMV感染肝活检进行双盲形态学观察,分析总结CMV肝炎的病理特征,并用免疫组织化学和PCR检测活检组织中CMV表达,分析其敏感性和特异性,寻找有价值的检测手段。获得如下主要结果和结论: 1.91例进行术中零时相活检,其中44.0%(40/91)的供肝术中活检呈现缺血再灌注损伤(IRI);具有IRI的供肝术后ACR和胆道并发症(BC)的同时发生率及晚期或持续性保存损伤(PI)出现率显著高于无IRI表现的供肝;中央型坏死和细胞凋亡严重程度与ACR和BC的发生率均显著相关;汇管区炎症程度与晚期或持续性PI的发生率相关。可见供肝术中零时相活检组织学特征与术后ACR、BC和PI的发生相关。 2.肝移植术后早期(6个月内)ACR发生率为38.0 %(89/234),原发疾病为重型肝炎和原发性肝癌的患者ACR发生率显著高于其他患者。21例非技术性BC中16例(76.2 %)例发生过一次或多次ACR,两者发生显著相关。早期活检ACR组中,汇管区的混合性炎细胞浸润、嗜酸性粒细胞浸润、汇管区胆管炎损、汇管区静脉内皮炎和中央静脉内皮炎的检出率分别为87.4%、65.8%、73.0%、69.4%和38.7%,与非排斥组比较具有显著性差异,是诊断ACR较敏感且特异的组织形态学指标。 ***组汇管区CD3+细胞、CD20+细胞、CD8+细胞均显著增加,而小叶内增加不明显,同时CD8+细胞和CD45RO+细胞胆管或血管浸润率显著增高。在ACR病例中,CD3+细胞和CD8+细胞浸润程度分别高于CD20+细胞和CD4+细胞,汇管区CD8+细胞和CD45RO+细胞浸润程度与排斥反应组织学分级显著相关。ACR组穿孔素、颗粒酶B在汇管区及小叶内的表达均显著增加且与ACR组织学分级及肝功生化指标AST和GGT升高成正相关,而TIA-1表达量在汇管区显著增加,小叶内无增加。胆管或血管壁毒性蛋白的阳性率也显著增高。 4.在CMV感染组和无CMV感染组间,组织中微小脓肿,单核细胞聚集及肝细胞体积增大的出现率具有显著差异,是CMV感染所致肝脏损伤的出现率高且特异的组织学改变。感染组抗CMV抗体检测阳性率20%;PCR检测阳性率72%。PCR和免疫组化检测CMV感染的敏感性和特异性分别为72%和84%,20%和100%,可见,活检石蜡组织中CMV的PCR检测是较敏感且特异的手段。

关键词：肝移植并发症移植物排斥反应保存损伤巨细胞病毒乙肝复发免疫表型细胞毒颗粒相关蛋白穿孔素颗粒酶B

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