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荔枝干制过程中类甜蛋白糖基化对炎症活性的影响

荔枝干制过程中类甜蛋白糖基化对炎症活性的影响

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作者：陈慧芳华南农业大学

学位级别：硕士

荔枝享有“岭南佳果”和“果中珍品”等美誉,有多种功效。但是,国内外的部分消费者在食用一定量的荔枝后出现“上火”反应,包括牙龈肿痛,口腔溃疡,发烧和发炎等症状,在一定程度上影响了消费者的健康。关于荔枝引起“上火”不良反应的原... 详细信息

荔枝享有“岭南佳果”和“果中珍品”等美誉,有多种功效。但是,国内外的部分消费者在食用一定量的荔枝后出现“上火”反应,包括牙龈肿痛,口腔溃疡,发烧和发炎等症状,在一定程度上影响了消费者的健康。关于荔枝引起“上火”不良反应的原因目前仍不清楚。本研究以荔枝果肉为原料,通过提取、分离、纯化得到高纯度荔枝类甜蛋白（Litchi Thaumatin-like Protein,Lc TLP）,并对其结构进行鉴定,通过建立巨噬细胞系RAW264.7炎症模型对促炎活性进行了评价。在此基础上模拟荔枝干制,探讨了不同加热时间对Lc TLP与果糖糖基化后复合物的结构以及促炎活性的影响,对构效关系进行了深入的探讨。主要研究结果如下:（1）采用低温法提取荔枝粗蛋白,通过透析、硫酸铵沉淀等得到了高纯度的蛋白。采用毛细管高效液相色谱仪联用电喷雾-组合型离子阱质谱仪（nano-LC-MS/MS）鉴定为荔枝类甜蛋白（Lc TLP）,并通过对Lc TLP基因测序进行了验证。Lc TLP的分子量为24 k Da,其主要二级结构为β-折叠（33%）。采用小角X射线散射（SAXS）解析了Lc TLP在溶液中的构象,结果表明,Lc TLP在溶液中是一个内部紧密,表面粗糙的球状结构。（2）Lc TLP的体外促炎活性实验结果表明:在2.5～10.0 ng/m L浓度范围内,Lc TLP对小鼠巨噬细胞具有一定的细胞毒性作用。Lc TLP（2.5～10.0 ng/m L）显著促进了NO的分泌,提高了诱导型一氧化氮合酶（i NOS）和环氧合酶2（COX-2）m RNA的表达量;同时,Lc TLP（2.5～10.0 ng/m L）也促进了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）白介素-6（IL-6）的基因表达量和分泌量的增加。（3）模拟荔枝干制过程,采用湿热法对Lc TLP和果糖进行糖基化反应,在恒温70℃,探究了不同加热时间（0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h）,对美拉德反应程度和蛋白多糖复合物结构的影响。结果表明随着加热时间的延长糖基化程度越大,接枝度从2.02%（3 h）增加到28.64%（48 h）。反应过程中Lc TLP-果糖复合物的二级结构所占比例发生变化,α-螺旋、β-转角以及无规卷曲发生了向β-折叠转变。糖基化过程中,Lc TLP-果糖复合物的粒子的尺寸随加热时间的增加而增加,平均粒径从628 nm（3 h）增加为897 nm（48 h）,蛋白质发生了一定程度的聚集。在加热过程中,Lc TLP-果糖复合物的内结构发生了解折叠,由表面粗糙的球状粒子逐渐向无序状态转变。（4）糖基化后的Lc TLP（M-Lc TLP）的体外促炎活性实验结果表明:在2.5～10.0ng/m L浓度范围内,M-Lc TLP对小鼠巨噬细胞无明显的细胞毒性作用（细胞活力＞90%以上）。与Lc TLP相比,M-Lc TLP显著（P＜0.05）降低了NO含量的分泌,抑制率达到65.25%。显著降低了COX-2和i NOS的基因表达量,同时也显著降低了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量和分泌量。

关键词：荔枝食物不耐受促炎活性类甜蛋白糖基化反应

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