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多酶恒温快速扩增结合侧流层析试纸条快速检测HAV的体系构建

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多酶恒温快速扩增结合侧流层析试纸条快速检测HAV的体系构建

作者：岳子晗中国医科大学

学位级别：硕士

目的:甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)感染是造成病毒性肝炎的原因之一,作为一种食源性病毒,HAV主要通过粪-口途径进行传播。快速准确地诊断HAV感染对于甲型肝炎的防治具有重要意义,本研究采用多酶恒温快速扩增(Multienzyme isothe... 详细信息

目的:甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)感染是造成病毒性肝炎的原因之一,作为一种食源性病毒,HAV主要通过粪-口途径进行传播。快速准确地诊断HAV感染对于甲型肝炎的防治具有重要意义,本研究采用多酶恒温快速扩增(Multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)结合侧流层析试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)和免疫磁珠富集法对HAV进行检测,该方法方便、灵敏、经济,尤其是适用于资源有限地区的检测,对于HAV的早期诊断和疫情控制具有重要作用。研究方法:针对HAV进行引物设计,合成HAV质粒,利用MIRA基本反应和琼脂糖凝胶电泳对引物进行评价,并结合LFD确定最低检测限。将质粒DNA进行10倍梯度稀释进行MIRA基本反应和MIRA-LFD反应,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)进行敏感性比对。利用多种病原体进行MIRA基本反应检测该反应的特异性。应用HAV减毒活疫苗进行RT-MIRA基本反应和RT-MIRA-LFD反应,利用免疫磁珠法富集水体中的甲肝病毒,评价富集效果。结果:经过MIRA-LFD反应的最低检测限为0.1拷贝/μL,RT-MIRA-LFD反应的最低检测限为1拷贝/μL,qPCR检测显示最低检测限为10拷贝/μL。其他病原体反应均无条带,LFD也为阴性结果。使用临床样本进行检测与qPCR结果一致。使用免疫磁珠法富集HAV,当HAV浓度为8.16×10～4拷贝/μL时,富集效率为91.38%,浓度为8.16×10～3拷贝/μL时,富集效率为59.44%,浓度为8.16×10～2拷贝/μL时,富集效率为34.07%,浓度为81.6拷贝/μL时,富集效率为18.84%。结论:***-MIRA反应在琼脂糖凝胶电泳中可以成功检测出HAV。***-MIRA结合LFD反应灵敏性高于qPCR,特异性强。3.免疫磁珠富集法可有效富集水中低浓度HAV。

关键词：甲型肝炎病毒多酶恒温快速扩增侧流层析试纸条免疫磁珠

基于核酸适配体的侧流层析试纸条快速检测真菌毒素研究

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基于核酸适配体的侧流层析试纸条快速检测真菌毒素研究

作者：王荷河北大学

学位级别：硕士

真菌毒素对人体健康具有巨大危害,寻求快速、高灵敏的真菌毒素检测技术一直是食品安全领域的研究热点。核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化技术从随机核酸文库中产生的DNA或RNA单链,可以折叠成具有高特异性和亲和力的高级结构来识... 详细信息

真菌毒素对人体健康具有巨大危害,寻求快速、高灵敏的真菌毒素检测技术一直是食品安全领域的研究热点。核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化技术从随机核酸文库中产生的DNA或RNA单链,可以折叠成具有高特异性和亲和力的高级结构来识别特定靶标。本研究将侧流层析技术和适配体结合,采用适配体互补链竞争方式建立了B族黄曲霉毒素的试纸条检测方法和同时快速检测赭曲霉毒素A(OTA)和黄曲霉毒素B(AFB)的多残留试纸条检测方法;利用自制的固相萃取(SPE)柱对样品实现了一步净化,为快速检测真菌毒素提供了理论基础和技术支持。主要研究内容如下:1.制备了一种适用于真菌毒素提取净化的SPE柱。将样品提取液通过SPE柱,通过优化提取试剂和净化条件,实现了OTA和B族黄曲霉毒素等毒素污染样品的一步净化。结果表明,使用该SPE柱的OTA和B族黄曲霉毒素的回收率为92.4%-102.9%,相对标准偏差(RSD)为1.0%-4.3%。利用该SPE柱,可使样品的前处理极大提高了效率,有利于实现真菌毒素的快速检测。2.建立了一种B族黄曲霉毒素的荧光侧流层析试纸条检测方法。该方法在已有的核酸适配体基础上,基于B族黄曲霉毒素与适配体的互补DNA之间的竞争,使用荧光染料Cy5作为适配体的标记,通过优化适配体的长度和浓度、检测线(T线)处的互补探针、缓冲液类型和离子浓度以及有机溶剂的比例等关键影响因素以提高检测B族黄曲霉毒素的灵敏度。首次将适配体的互补链用作T线构建B族黄曲霉毒素适配体试纸条,实现B族黄曲霉毒素的快速定量检测。该方法定量检测B族黄曲霉毒素的线性范围为0.2-20 ng/m L,检出限为0.16 ng/m L,且特异性良好。在花生、杏仁和无花果干等样品中的加标回收率为93.3%-112.0%,RSD为2.7%-7.9%,该结果与HPLC-MS/MS方法准确性一致。该方法具有成本低、分析速度快和操作方便等优点,为现场快速检测B族黄曲霉毒素提供了新型的快速检测技术,具有良好的应用前景。3.建立了一种OTA和AFB同时检测的核酸适配体多残留试纸条方法,该方法基于OTA和AFB与适配体互补链竞争结合两种适配体,通过优化适配体的浓度以及缓冲体系的p H值,提高了同时检测OTA和AFB的灵敏度和准确性,实现了OTA和AFB的同时快速定量检测。该方法在OTA和AFB的浓度分别为0.5-50 ng/m L时具有良好的线性关系,相关系数R分别为0.9887和0.9910,检出限分别为0.51 ng/m L和0.38 ng/m L,检测结果的特异性良好。通过对花生和葡萄干等样品中加标回收,结果表明OTA和AFB的回收率分别为82.1%-109.7%和83.3%-110.1%,RSD为1.9%-8.2%。经与HPLC-MS/MS方法比对实验证明该方法的准确性良好。该方法操作简单、灵敏度高,为真菌毒素OTA和AFB的同时检测提供理论依据和技术支撑。

关键词：真菌毒素适配体侧流层析试纸条多残留试纸条固相萃取柱

BVDV、BPIV3反转录重组酶聚合酶扩增侧流层析试纸条（RT-RPA LFD）双重检测方法的建立

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BVDV、BPIV3反转录重组酶聚合酶扩增侧流层析试纸条（RT-RPA LFD...

作者：杨森中国农业科学院

学位级别：硕士

牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是犊牛断奶前发病率和死亡率最高的疾病,占总死亡率的18.1%,严重影响饲育牛的健康。世界范围内每年因BRDC造成的损失高达数百亿。BRDC是一种多病原体疾病综合征,早期常因病... 详细信息

牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是犊牛断奶前发病率和死亡率最高的疾病,占总死亡率的18.1%,严重影响饲育牛的健康。世界范围内每年因BRDC造成的损失高达数百亿。BRDC是一种多病原体疾病综合征,早期常因病毒(BVDV、BPIV3、Bo HV-1、BRSV和IDV)感染导致宿主抵抗力下降,后继发感染细菌(溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌等)与支原体,从而产生强烈的炎症反应。早期对病毒性病原作出诊断并采取相应措施能够有效的控制BRDC,传统的检测手段不够敏感且很难区分何种病原体感染,因此临床亟需一种操作简便、特异、敏感的病毒诊断技术和产品,养殖户可自行检测与筛查。本研究便建立了一种快捷高效的检测BVDV和BPIV3的方法,该方法不需要昂贵的仪器设备、复杂的实验步骤,能够及时准确地对疾病作出诊断,同时该方法具有优异的敏感性,避免了因病牛处于亚临床阶段(病毒载量低)出现漏诊而导致疫病流行。本研究采用了重组酶聚合酶扩增(RPA)的方法,能够在恒温条件下快速扩增出病毒目的核酸片段,考虑到现场环境中处理样品的不便,对方法进行改进,在RPA体系之中引入反转录酶,能够直接检测出样品中的病毒RNA。为了快速得到诊断结果,该方法借助侧流层析试纸条(LFD)检测RPA扩增产物,10分钟之内即可通过肉眼观测结果。为了区分BVDV和BPIV3,本实验在上述RT-RPA LFD反应组分中加入针对BVDV 5’-UTR和BPIV3 P蛋白基因的引物和nfo探针,结合双重检测试纸条即可同时检测BVDV和BPIV3,能够在一定程度上减少人力与物力的使用。本研究对上述方法的反应条件进行优化,最终确定RT-RPA反应的最佳反应条件为35℃下孵育25分钟。该方法的敏感性较高,其中BVDV的最低检出限为50个RNA分子,BPIV3的最低检出限为34个RNA分子。该方法同样具有很理想的特异性,与CSFV、IBRV、BRSV等病毒无交叉反应。通过检测129例临床样品验证其检测性能,并与RT-q PCR进行比较,RT-RPA LFD方法的灵敏度为98.1%,特异性为100%,对两者结果进行独立样本t检验(t=0.054,p=0.987;P>0.05),两组检测结果之间无统计学差异(P>0.05);使用该方法对国内具有代表性的流行毒株进行检测,结果表明此双重检测方法对于国内流行株的诊断具有很高的普适性。由于RPA反应本身的优异性,无需复杂的热循环仪器,操作更加方便快捷且样品来源广泛,对样品或环境中的核酸扩增抑制剂的耐受性更强,且对BVDV和BPIV3等单链RNA病毒的高突变率具有更好的包容性。相比于传统检测手段,本研究所建立的双重BVDV和BPIV3的RT-RPA LFD检测方法更加适合于条件有限的情况下开展大规模的病毒筛查与疾病净化。

关键词：牛病毒性腹泻病毒牛副流感病毒3型重组酶聚合酶扩增侧流层析试纸条

碳纳米管标记的侧流层析试纸条对黄曲霉毒素B1的检测

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碳纳米管标记的侧流层析试纸条对黄曲霉毒素B1的检测

作者：潘虹儒安徽科技学院

学位级别：硕士

黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性极强的生物致癌剂,对肝脏组织的破坏性极强,经常接触会导致慢性中毒,有诱发癌症的风险。AFB1容易在高温和潮湿的环境中滋生,污染粮食作物及农畜产品。近年来,我国食药监管局对市场上的谷物、粮油等食品进行... 详细信息

黄曲霉毒素B1（AFB1）是毒性极强的生物致癌剂,对肝脏组织的破坏性极强,经常接触会导致慢性中毒,有诱发癌症的风险。AFB1容易在高温和潮湿的环境中滋生,污染粮食作物及农畜产品。近年来,我国食药监管局对市场上的谷物、粮油等食品进行抽检时,常有AFB1检出量超标的情况。AFB1一旦滋生难以通过日常的烹饪去除,因此需开发出能快速、灵敏对AFB1进行现场检测的方法来预防中毒事件的发生。侧流层析技术是一种耗时短、操作简便的可视化检测技术,本研究基于竞争法的抑制机理,以碳纳米管代替胶体金来标记抗体,构建了可现场检测AFB1的高灵敏度侧流层析试纸条,并评价其性能。（1）优化碳纳米管标记的侧流层析试纸条的制备条件。首先,酸化多壁碳纳米管（MWCNTs）,制备出MWCNTs和AFB1抗体的偶合物。优化后的MWCNTs酸化条件为:使用30-50 nm的MWCNTs在5.4 mL浓硫酸和1.8 mL浓硝酸中超声反应3小时。选择EDC、NHS活化法与AFB1单克隆抗体相连,确定MWCNTs-McAb偶合物中抗体的添加量为20 μg/mL,缓冲液中PVP的添加量为1%,选择170 s膜作为试纸条NC膜的材料,并在NC膜上喷划浓度为2.5 mg/mL的AFB1-BSA作为试纸条的检测线。（2）进一步探究试纸条的分析特性,结果表明本研究构建的试纸条在最优条件下有很高的灵敏度,肉眼可检测到0.25 ng/mL的AFB1,对0.005-0.5 ng/mLAFB1的检测结果有着良好的线性关系,线性回归方程为y=34.615x+0.6803,计算出的最低检测限为0.0052 ng/mL,且不与其他毒素产生交叉反应,多次检测结果一致性高,能在室温下保存两个月不变质。因此该试纸条具备优良的分析性能,可以满足对AFB1的快速现场检测要求。

关键词：黄曲霉毒素B1 碳纳米管竞争法侧流层析试纸条

基于核酸适配体的侧流层析试纸条用于有机磷农药残留检测的研究

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基于核酸适配体的侧流层析试纸条用于有机磷农药残留检测的研究

作者：肖华湖南大学

学位级别：硕士

我国是世界上第一大粮食和蔬菜生产国和消费国。为了保证食品安全,我国组织实施了“全国无公害食品行动计划”,农产品质量安全、“吃放心菜”也因此成为了我国的重点民生问题。其中,农药残留带来的食品安全问题以及环境污染问题受到人... 详细信息

我国是世界上第一大粮食和蔬菜生产国和消费国。为了保证食品安全,我国组织实施了“全国无公害食品行动计划”,农产品质量安全、“吃放心菜”也因此成为了我国的重点民生问题。其中,农药残留带来的食品安全问题以及环境污染问题受到人们的持续关注。作为使用最广泛的农药,有机磷农药的过度使用导致了农田的水体、土壤、植被中大量的农药残留,不仅造成严重的环境污染,同时也对人体健康和生态安全构成巨大威胁。因此,需要及时检测环境和农产品中的有机磷农药残留。目前,有机磷农药残留的检测主要依赖于色谱、光谱等传统的仪器分析手段。这些方法需要昂贵的仪器设备,专业的技术操作以及复杂的样品前处理过程,存在成本高、操作复杂、检测场地有限、检测耗时长等缺点。然而,对于偏远农村地区来说,缺少检测条件。对于农产品流通性很强的市场来说,实验室检测显然效率十分低下,无法满足需求。大型仪器检测方法无法在条件有限的偏远地区展开检测,以及难以在市场流通性很强的城市中实现大规模家庭自检。因此,亟需开发简单、快速、灵敏、低成本的检测方法,实现在农业生产和市场中有机磷农药残留的即时和大规模的自我检测。胶体金免疫层析试纸条方法是一种快速、简便的分析检测技术,由于抗原-抗体的选择性结合作用,在试纸条上直接滴加待测样品即可实现对目标分子的快速分析。但是,基于抗体的胶体金免疫层析试纸条技术需要合成和纯化抗体,所需成本高,生产周期长。并且,抗体的稳定性通常较差,面对复杂的环境样本和多变的检测条件,试纸条检测结果容易出现“假阴性”或者“假阳性”。核酸适配体是一种经体外筛选技术得到的、具有识别能力的单链核酸分子,其亲和力和特异性可与抗体相媲美。由于核酸分子的易得性和稳定性,核酸适配体因而还具有易于合成、稳定性高、生产成本低等显著优势,近年来被广泛应用于生物传感、生物成像等诸多领域。将核酸适配体作为识别分子引入胶体金免疫层析试纸条技术,能够显著提高技术稳定性,降低制作成本,缩短制作周期。在本论文中,我们设计并构建了一种基于有机磷农药核酸适配体的侧流层析试纸条方法,可实现实际样品中有机磷农药残留的快速、灵敏检测。具体研究内容如下:(1)核酸适配体的有机磷农药试纸条检测方法研究。我们利用竞争结合原理,设计了利用核酸适配体检测有机磷农药的方法。为了验证该方法的可行性,我们首先利用农药适配体合成了纳米金-DNA偶联物并表征了其形貌。结果显示纳米金颗粒尺寸均一、形貌规整,DNA成功偶联到了纳米金表面。进一步,我们在溶液中检验了纳米金-DNA偶联物对有机磷农药丙溴磷的选择性检测能力。结果显示偶联物能够选择性、浓度依赖地对丙溴磷产生响应,农药适配体成功从偶联物上解离并与丙溴磷结合,证明我们的方法对试纸条检测有机磷农药具备良好的可行性。(2)基于核酸适配体的胶体金层析试纸条制备及应用。我们按照设计原理制备了试纸条,并对试纸条进行了工艺和检测条件的优化,最终确定了优化后的最佳条件。我们使用优化的条件制作了试纸条,并检验了试纸条检测有机磷农药标准样品的能力。结果表明,试纸条能在10分钟内对丙溴磷、水胺硫磷、氧化乐果三种有机磷农药进行检测,其中对丙溴磷标准样品的检测在0.1到500 μM范围内呈现良好的对数线性相关关系。最后,我们在娃娃菜实际样品中检测了丙溴磷样品,在实际样品的加标回收实验中测得回收率为81%-108%,每个浓度下的相对标准偏差均小于12%。结果表明,我们所设计的试纸条能够实现实际样品中有机磷农药的快速、准确检测。

关键词：胶体金侧流层析试纸条核酸适配体有机磷农药残留

神奇的农残检测试纸条——用于有机磷农药残留检测的核酸适配体侧流层析试纸条

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大学化学 2024年第5期39卷 80-89页

作者：方琪珑李懿绮生江伊徽袁荃谈洁湖南大学化学化工学院长沙410082

有机磷农药是农业生产中使用最广泛的农药之一,其大量使用造成了农作物表面、水体和土壤等环境中的农药残留,严重破坏生态环境,威胁人体健康。因此,快速、准确地检测环境中的有机磷农药残留对于控制农药使用和污染具有重要意义。传统色... 详细信息

有机磷农药是农业生产中使用最广泛的农药之一,其大量使用造成了农作物表面、水体和土壤等环境中的农药残留,严重破坏生态环境,威胁人体健康。因此,快速、准确地检测环境中的有机磷农药残留对于控制农药使用和污染具有重要意义。传统色谱、光谱检测方法依赖于大型仪器和专业的技术人员,存在检测成本高、耗时长等缺点。因此,本文创新性地制备了一种基于核酸适配体的胶体金侧流层析试纸条,用于果蔬中有机磷农药残留的快速和准确检测。由于该试纸条具有灵敏、便携、易于操作的优点,能现场应用在实际的蔬菜样品检测中,具有很好的科普性和可推广性。另外,本科普实验操作过程逻辑清晰、内容详实,并且针对不同类别的人群,设计多样化的实验过程和实验方案,能够很好地激发大家对化学的兴趣和提升对食品安全的意识。

关键词：胶体金侧流层析试纸条核酸适配体有机磷农药科普

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LAMP耦合荧光侧向流层析试纸条的空间微生物快速检测技术

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空间科学学报 2023年第2期43卷 302-309页

作者：韩培侯红渠樊云龙王文甲吕雪飞张伟李晓琼中国科学院空间应用工程与技术中心北京100094 北京理工大学生命学院北京100081

微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环... 详细信息

微生物种类及其含量监测是空间站内微生物控制的重要环节。但是空间环境的微重力条件及对资源的条件限制导致地面常规检测实验难以开展,因此在轨微生物检测主要依靠培养法。基于侧流层析试纸条的生物分子识别检测方法具有不受微重力环境影响的优点,耦合荧光检测方法可以达到较高的检测灵敏度,是在轨微生物检测的潜在方法之一。针对空间环境中对航天员生活环境及仪器仪表设备具有潜在危害的微生物,研究了一种基于环介导等温扩增(LAMP)耦合荧光侧流层析试纸条的微生物核酸鉴别技术。研究结果表明,该技术可实现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等空间站常见有害微生物的高灵敏、高特异性、快速检测,检测时间小于60 min,灵敏度达到100 copy·μL^(–1)。

关键词：空间微生物侧流层析试纸条环介导等温扩增

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逆转录多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测牛冠状病毒方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2024年

作者：杨德全张校培李鑫沈海潇杨显超葛菲菲鞠厚斌赵洪进向蒙冯桂丹王建黄士新上海市动物疫病预防控制中心安徽农业大学动物科技学院

为建立一种用于临床快速诊断牛冠状病毒的检测方法，针对牛冠状病毒N基因的保守序列设计特异性引物和探针，通过优化反应温度和时间，确定了最佳反应条件，然后进行了敏感性、特异性和重复性试验，并进行临床应用。结果显示：该方法特... 详细信息

为建立一种用于临床快速诊断牛冠状病毒的检测方法，针对牛冠状病毒N基因的保守序列设计特异性引物和探针，通过优化反应温度和时间，确定了最佳反应条件，然后进行了敏感性、特异性和重复性试验，并进行临床应用。结果显示：该方法特异性较好，牛冠状病毒与牛轮状病毒、牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛星状病毒、牛嵴病毒、牛环曲病毒等肠道病毒无明显交叉反应；反应过程均在42℃恒温条件下完成，用时15min即可得到扩增结果；反应体系可检测的最低扩增拷贝数为18copies/μL，敏感性较高；利用该方法和荧光RT-PCR对206份牛粪便样品进行检测，该方法的敏感度为92.85%，特异度为100.00%，阳性预测值均为100.00%，阴性预测值为98.88%，两种方法一致性极好（Kappa值>0.8）。结果表明，本研究建立的RT-MIRA-LFD快速检测 BCoV方法具有简便快速、灵敏度高、特异性好等优势，不依赖于实验室仪器和专业人员水平，可用于BCoV 的快速现场检测和流行病学监测。

关键词：牛冠状病毒逆转录多酶恒温快速扩增侧流层析试纸条

金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用

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食品科学 2022年第4期43卷 331-339页

作者：后来旺李达容邓波赵勇潘迎捷丰东升孙晓红上海海洋大学食品学院上海201306 上海市农产品质量安全中心上海201799 农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海) 上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速检测方法。该方法在引物浓度200 nmol/L、33℃反应20 min即可实现靶标基因片段的有效扩增。特异性分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌与其他常见致病菌菌株间不存在交叉反应,灵敏度分析结果表明RAA-LFD方法检测金黄色葡萄球菌的检出限为4 fg/μL(DNA)与1.83×10^(2) CFU/mL(纯菌液)。用人工污染牛奶样品验证RAA-LFD方法的可靠性,结果显示在增菌6 h时,RAA-LFD方法可检测到1.83×10^(1) CFU/mL金黄色葡萄球菌。分别采用微生物生化鉴定法、PCR法与RAA-LFD方法对64份牛奶样品进行金黄色葡萄球菌检测,结果表明,RAA-LFD方法与微生物生化鉴定法总符合率为95.3%,与PCR法总符合率(98.4%)表现出较高的一致性。本研究建立的可视化检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简单、检测结果直观、对仪器设备要求低等特点,为牛奶中金黄色葡萄球菌的检测提供新的发展方向。

关键词：金黄色葡萄球菌重组酶等温扩增技术侧流层析试纸条快速检测

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