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苯并咪唑广谱性及多菌灵高灵敏性单克隆抗体的制备及侧流层析免疫...

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作者：李子哲河南农业大学

学位级别：硕士

苯并咪唑类化合物主要包括阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、芬苯达唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、氟苯达唑、奥苯达唑、甲苯达唑、噻苯达唑、甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵（carbendazim,CBZ）等。阿苯达唑、芬苯达唑和甲苯达唑等常作... 详细信息

苯并咪唑类化合物主要包括阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、芬苯达唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、氟苯达唑、奥苯达唑、甲苯达唑、噻苯达唑、甲基硫菌灵、苯菌灵和多菌灵（carbendazim,CBZ）等。阿苯达唑、芬苯达唑和甲苯达唑等常作为抗寄生虫药物应用于畜牧业,由于这些化合物具有一定的致畸作用和胚胎毒性,我国规定了它们在动物源性食品中最大残留限量（Maximum Residue Limit,MRL）为0.01-5 mg/kg。CBZ是一种内吸性广谱杀菌剂,广泛应用于果蔬菜的真菌病害防治,也具有一定毒性,我国规定了其在果蔬等中的MRL为0.05-5 mg/kg。因此,建立食品中苯并咪唑类化合物残留的快速检测方法,十分必要。胶体金侧流层析免疫分析法（Colloidal Gold Lateral Flow Immunoassay,CG-LFA）因其操作简便、检测快速等特点深受现场检测的欢迎。然而,广谱性苯并咪唑抗体的缺乏以及CBZ抗体的灵敏度较低,构成了制约免疫分析技术发展的主要瓶颈。因此,本研究旨在制备广谱性苯并咪唑抗体及高灵敏度CBZ的单克隆抗体,并以此建立相关的LFA,为苯并咪唑化合物的快速检测提供一定的方法学基础。首先,以CBZ为苯并咪唑类化合物的公共骨架,从CBZ的苯环上分别引入羧基和苯甲酸,设计半抗原H1和H2,充分暴露苯并咪唑氨基甲酸酯结构,以制备苯并咪唑广谱性抗体。以2-氨基苯并咪唑为公共骨架,分别引入丁二酸酐、4-异氰酸丁酸乙酯和对苯二甲酸分别制备半抗原H3、H4和H5,充分暴露苯并咪唑环结构,以制备高灵敏度CBZ的抗体。经过高斯运算和分子叠合等计算化学技术发现:半抗原H2间隔臂与公共骨架部分产生了-27.14°的角度差,该构象有利于更好的暴露公共骨架,并且其间隔臂充分保留了氨基甲酸酯部分的电荷特征和构象,仅对苯环部分的电荷产生轻微干扰,是制备广谱性苯并咪唑化合物抗体最优半抗原;半抗原H5的苯环间隔臂可较好地隔离了活性基团对间隔臂及抗原表位的电荷干扰,是制备CBZ高灵敏抗体的最优半抗原。此外,采用活泼酯法偶联载体蛋白,合成完全抗原,紫外分光光度法表明完全抗原合成成功。其次,采用单克隆抗体制备技术,分别通过H1-KLH制备出mAb 14G9和mAb 7B1,H2-KLH制备出mAb 9E5和mAb 3F1,H3-KLH制备的mAb 10A9、mAb 6D5、mAb 8D3和mAb 3H10,H4-KLH制备出mAb 3A3和mAb 5B10,H5-KLH制备出mAb 3B9和mAb 4B11,共12株单克隆抗体。采用间接竞争酶联免疫实验对抗体性能进行评估,其中,mAb 9E5对CBZ、苯菌灵、甲基硫菌灵、阿苯达唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、芬苯达唑、芬苯达唑砜、奥芬达唑、甲苯达唑、奥苯达唑和氟苯达唑12种苯并咪唑药物的半抑制浓度(IC50值)分别为2.65、42.1、3.57、1.96、1.85、2.88、1.65、2.34、1.89、1.08、3.22和2.46 ng/m L,交叉反应率在42.1-240.2%,是文献报道苯并咪唑化合物识别力最广谱的抗体;mAb 4B11对CBZ的IC50值为0.04 ng/m L,对苯菌灵和甲基硫菌灵的交叉反应率分别为15.2%和1.06%,是文献报道灵敏度最高的CBZ抗体。最后,通过对包被原浓度、抗体添加量和金标抗体添加量的优化,以H2-BSA-mAb 9E5为抗原抗体组合,建立了同步检测牛奶中12种苯并咪唑化合物的LFA,对上述12种苯并咪唑药物的IC50值分别为1.29、1.83、7.82、0.74、0.73、0.68、2.27、1.84、1.79、1.99、1.98和1.62 ng/m L,cut-off值分别为10、20、40、10、10、10、20、20、10、10、10和20 ng/m L;以H4-BSA-mAb 4B11为抗原抗体组合,建立了果蔬中CBZ高灵敏检测的LFA,韭菜、芦笋、缸豆、橘子、葡萄和草莓样品中的LOD分别为0.18、0.10、0.11、0.16、0.12和0.13 ng/m L,添加回收率为76.0%-96.1%,真实样本中的检测与高效液相色谱检测结果一致。本研究分别以CBZ和2-氨基苯并咪唑环为苯并咪唑类化合物和CBZ的骨架结构,设计半抗原,验证了半抗原与载体蛋白的连接位点对抗体识别力的影响,半抗原的间隔臂类型对于抗体灵敏度的影响,为小分子化合物抗体的定向制备提供了一定的理论依据。此外,本研究构建了牛奶中同步检测12种苯并咪唑类化合物的LFA及果蔬中高灵敏检测CBZ的LFA,给苯并咪唑化合物的检测提供了坚实的方法学基础。

关键词：苯并咪唑多菌灵半抗原设计单克隆抗体侧流层析免疫分析法

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