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重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流动试纸条快速检测锦鲤疱疹病毒

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水生生物学报 2023年第6期47卷 866-873页

作者：楚馨冯梓钊姜有声王浩吕利群许丹上海海洋大学国家水生动物病原库上海201306 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心上海201306

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增... 详细信息

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率。结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现。研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑。

关键词：快速检测重组酶聚合酶扩增技术侧向流动试纸条锦鲤疱疹病毒

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

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水生生物学报 2024年第5期48卷 849-858页

作者：王姝然徐嘉楠范厚勇郑跃平周天琦张也许丹上海海洋大学上海201306 上海海洋大学国家水生动物病原库上海201306 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海市水生野生动植物保护研究中心上海200092

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和... 详细信息

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。

关键词：快速检测重组酶聚合酶扩增技术侧向流动试纸条嗜水气单胞菌

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弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

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大连海洋大学学报 2024年第2期39卷 241-249页

作者：王姝然范厚勇徐嘉楠周天琦许丹郑跃平上海海洋大学水产与生命学院上海201306 上海海洋大学国家水生动物病原库上海201306 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室上海201306 上海市水生野生动植物保护研究中心上海200092

为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖... 详细信息

为建立一种针对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)敏感性高、特异性强的临床快速检测方法,根据该菌定居因子基因cfa的保守序列,设计特异性引物,采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),并结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)方法进行反应条件的优化及特异性与灵敏度的检测。结果表明:本研究中所建立的弗氏柠檬酸杆菌重组酶聚合酶扩增结合侧向流动试纸条(RPA-LFD)快速检测方法,在38℃条件下扩增20 min后,能特异性地检测到弗氏柠檬酸杆菌,对弗氏柠檬酸杆菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限分别为1.5×102 CFU/mL和200 fg/μL,是常规PCR(cfa引物)检测灵敏度(20 pg/μL)的100倍;利用所建立的RPA-LFD法与常规PCR同时检测杂交鲟攻毒试验样本,两种方法的检测结果一致。研究表明,本研究中建立的弗氏柠檬酸杆菌RPA-LFD方法,操作简便、反应迅速、特异性好、灵敏度高,并且不需要昂贵的仪器,该方法可为未来弗氏柠檬酸杆菌细菌性疾病的早期诊断提供更有效的技术支持。

关键词：弗氏柠檬酸杆菌快速检测重组酶聚合酶扩增技术侧向流动试纸条

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双亲链修饰的金纳米花探针增强试纸条检测玉米酒精糟中玉米赤霉烯酮的稳定性

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双亲链修饰的金纳米花探针增强试纸条检测玉米酒精糟中玉米赤霉烯...

作者：马彤彤南昌大学

学位级别：硕士

因具有检测速度快、操作简单和成本低廉等优点,免疫层析技术现已被广泛应用于现场检测。传统的胶体金免疫层析试纸条（Colloidal gold immunochromtographic assay）的标记物为20～40nm球形胶体金,因其光学信号弱,导致其检测灵敏度偏低... 详细信息

因具有检测速度快、操作简单和成本低廉等优点,免疫层析技术现已被广泛应用于现场检测。传统的胶体金免疫层析试纸条（Colloidal gold immunochromtographic assay）的标记物为20～40nm球形胶体金,因其光学信号弱,导致其检测灵敏度偏低,限制了其在痕量分析中的应用。另外,胶体金试纸条检测一些基质较复杂的样本（如组织样本,饲料样本以及某些粉状基质样本）仍需要复杂的前处理操作去除样本中基质的干扰,从而大大降低了试纸条的检测便利性。相比于球形胶体金,同粒径的金纳米花（AuNFs）摩尔消光系数更高,显色更强,作为信号载体,可提高试纸条的检测性能。此外,将金纳米花的表面修饰配体可极大地提高其在复杂基质中的抗干扰能力,提高检测稳定性。玉米酒精糟饲料样本（DDGS）因组分复杂,会严重降低传统胶体金免疫层析方法的灵敏度、线性范围、准确度和精密度。因此本文旨在利用双亲配体修饰的羧基化金纳米花共价标记抗体制备显色探针,增强其抗基质干扰能力,以提高DDGS中玉米赤霉烯酮（ZEN）的检测稳定性。本课题研制的双亲性配体一端为含巯基的疏水烷烃链,中间含乙二醇单元,而末端含羧基官能团。双亲性配体通过金硫（Au-S）键修饰AuNFs,然后通过将ZEN抗体的氨基与AuNFs的羧基共价偶联获得N-AuNF-Abs。同时,采用传统静电吸附法制备获得了 Tr-AuNF-Abs。首先针对两种金纳米花及探针在离子强度和pH值的耐受性方面进行对比,然后将两种探针应用于免疫层析试纸条,系统对比了耐离子强度和pH耐受、缓冲液和实际样本基质中的ZEN检测灵敏度、稳定性和重现性及产品保质期等多方面性能。对比结果表明本研究所合成的N-AuNFs、N-AuNF-Abs以及N-LFA抗环境干扰能力优异。N-LFA检测磷酸缓冲液中ZEN的IC5O值为15.97ng/mL,Tr-LFA的IC5O值为31.06ng/mL;N-LFA检测玉米酒精糟提取液中ZEN的IC5O值为17.46ng/mL,同时Tr-LFA检测重现性较差,无法实现准确定量。加标回收实验结果显示,N-LFA检测玉米酒精糟中ZEN的批内及批间平均回收率为93.0%-125.9%（变异系数介于2.8%-21.9%之间）。以上结果表明,N-LFA检测复杂玉米酒精糟中ZEN仍具有良好的稳定性和准确度。加速老化研究中,N-LFA的货架期（5年）远优于Tr-LFA（1年）。总之,本研究提供了一种制备稳定性优异的金纳米花探针的方法,所制备探针能有效提高免疫层析技术在检测复杂基质如玉米酒精糟中小分子物质的检测性能。

关键词：侧向流动试纸条金纳米花双亲性配体共价偶联玉米赤霉烯酮玉米酒精糟基质效应

基于环介导等温扩增检测人乳头瘤病毒基因的相关方法研究

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基于环介导等温扩增检测人乳头瘤病毒基因的相关方法研究

作者：黄月明贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:(1)建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus 58,HPV58)基因检测体系,用于其快速检测和早期诊断。(2)利用环介导等温扩增技术的等温优势与侧向流动试纸条技术的简便性相结合,建立一种用于HPV16、HP... 详细信息

目的:(1)建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus 58,HPV58)基因检测体系,用于其快速检测和早期诊断。(2)利用环介导等温扩增技术的等温优势与侧向流动试纸条技术的简便性相结合,建立一种用于HPV16、HPV58的快速目视检测方法。方法:(1)运用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在线引物设计软件Primer Explorer V5,针对人乳头瘤病毒58型的L1基因保守区域设计引物,在反应前加入荧光核酸染料SYBR GreenⅠ,并对该反应体系中的d NTPs、Mg SO和引物浓度进行优化,优化结果通过"S"型扩增曲线判断,并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。(2)运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16的E6基因保守区域及HPV58L1基因的保守区域设计引物及探针。采用生物素标记环引物,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,侧向流动试纸条用于扩增产物可视化检测,从而建立HPV16、HPV58的LAMP-LFD检测方法,分别对反应体系的特异性、灵敏度和临床实用性进行了验证,将LAMP-LFD检测临床DNA样本的结果与实时荧光LAMP扩增及临床实验室检测(q PCR法)得到的结果进行比较。结果:(1)针对人乳头瘤病毒58型基因所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度,且与临床实验室检测结果(q PCR方法)的符合率达100%,该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL。(2)成功构建了LAMP-LFD反应体系,对体系优化后的最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50 min。LFD的检测仅需5 min,故完成检测耗时仅55 min;建立的LAMP-LFD能特异性检出HPV16、HPV58,对其他几种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μL,对50份临床样本的检测结果与实时荧光LAMP和临床实验室检测的符合率达100%。结论:(1)本研究建立了人乳头瘤病毒58型基因的实时荧光环介导等温扩增检测体系,它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法,适用于HPV临床样本的快速检测及早期筛查。(2)同时,构建了HPV16、HPV58的LAMP-LFD检测体系,该方法是一种快速、简便的目视检测方法。对仪器设备要求低,仅需恒温孵育器即可完成,且检测结果易观察,适用于现场检测及资源匮乏地区的HPV筛查。

关键词：环介导等温扩增技术人乳头瘤病毒实时荧光法侧向流动试纸条现场检测

基于Cas12a/sgRNA平台快速准确鉴定金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

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基于Cas12a/sgRNA平台快速准确鉴定金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金...

作者：曹小英重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的感染率和死亡率高,临床细菌的培养方法需要较长的时间（2-4天）,经验性的用药很可能导致多重耐药... 详细信息

背景:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的感染率和死亡率高,临床细菌的培养方法需要较长的时间（2-4天）,经验性的用药很可能导致多重耐药,同时也延误病期,目前相关细菌的快速检测方法较欠缺。目的:为了确保耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的预防和控制,必须对病原菌及其耐药表型进行准确的检测和鉴定。因此,本研究旨在建立一个实用、准确的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸检测平台。方法:通过设计针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）和mec A基因的sg RNAs,初步构建了CRISPR/Cas12a检测系统。为了提高CRISPR/Cas12a系统的灵敏度,实验结合了PCR、环介导的等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）技术。随后,比较了三种不同的扩增方法与CRISPR/Cas12a系统配对的敏感性和特异性。最后,通过对111株临床分离株的荧光读数进行分析,验证了该方法的临床性能。为了将结果可视化,还利用了能够进行即时测试的侧向流动测试条技术。结果:比较了三种不同方法的敏感性和特异性。确定了nuc-LAMP-Cas12a和mec A-LAMP-Cas12a法为最佳检测方法。研究发现,nuc-LAMP-Cas12a平台的检测限为10 a M(～6拷贝μL-1),而mec A-LAMP-Cas12a平台的检测限为1a M(～1拷贝μL-1)。两个平台的LOD均达到4×10～3fg/μL基因组DNA。通过对111株临床分离株的验证评价,该平台的敏感性和特异性均达到100%。nuc-LAMP-Cas12a和mec A-LAMP-Cas12a检测方法的整个检测时间约为80分钟（基于荧光读数）或85分钟（基于侧向流动试纸条）。结论:本研究开发了nuc-LAMP-Cas12a和mec A-LAMP-Cas12a平台用于检测金黄色葡萄球菌和鉴定MRSA。首先,本实验建立了一个初步的CRISPR/Cas12a检测系统,之后将PCR、LAMP和RPA扩增纳入CRISPR/Cas12a系统以提高灵敏度。随后,我们根据三种不同方法的灵敏度和特异性选择了最佳检测方法。本研究的一个关键优势是将恒温扩增技术与侧流试纸技术相结合,无需使用复杂的分子实验设备,从而实现了即时检测。在对111个临床分离菌株进行验证评估后,两个平台的灵敏度和特异性均达到100%。整个检测时间约为80分钟（基于荧光读数）或85分钟（基于侧向流动试纸条读数）。最后,本研究为检测金黄色葡萄球菌和鉴定MRSA提供了经济、方便、快速和精确的核酸平台。由于开发的CRISPR/Cas12a检测平台不需要任何昂贵的仪器,它将在微生物实验室中流行,并可用于偏远地区MRSA的诊断、治疗和监测。

关键词：金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌规律成簇的间隔短回文重复-Cas相关蛋白恒温扩增聚合酶链式反应环介导等温扩增重组酶聚合酶扩增侧向流动试纸条

菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术快速检测方法的建立与应用

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江苏农业科学 2023年第14期51卷 70-75页

作者：朱宇翔秦嘉超季英华陈新陈学好崔晓艳江苏省农业科学院经济作物研究所江苏南京210014 扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009 江苏省农业科学院植物保护研究所江苏南京210014

根据菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus,简称BYMV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立蚕豆中BYMV的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)检测方法。同时,将该方法与侧向流动试纸条(L... 详细信息

根据菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus,简称BYMV)外壳蛋白基因序列的保守区设计特异性引物和探针,建立蚕豆中BYMV的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,简称RPA)检测方法。同时,将该方法与侧向流动试纸条(LFD)检测方法相结合,建立RPA-LFD快速检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,该方法可在37~42℃等温条件下进行,30 min即可完成检测。灵敏度试验表明,采用RPA-LFD方法检测BYMV的灵敏性是PCR方法的100倍。在特异性试验方面,与同属于马铃薯Y病毒属亲缘关系较近的大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,简称SMV)、菜豆普通花叶病毒(bean common mosaic virus,简称BCMV)和芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,简称TuMV)无交叉反应。因此,本研究建立的菜豆黄花叶病毒RPA-LFD技术检测快速、灵敏且高效,有望成为我国菜豆黄花叶病毒田间诊断与防控的实用性技术手段。

关键词：菜豆黄花叶病毒重组酶聚合酶扩增侧向流动试纸条病毒检测

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