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基于适配体识别卡那霉素的侧向层析试纸条新方法研究

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基于适配体识别卡那霉素的侧向层析试纸条新方法研究

作者：常芮江南大学

学位级别：硕士

侧向层析试纸条(LFS)具有操作简单、携带方便、检测快速等优点,并可用于实时检测和临床检测,因此得到了广泛的应用。金纳米材料的表面容易修饰,具有特殊的光学性质和一定的催化能力。利用金纳米材料的特性,将其作为信号分子应用于LFS上... 详细信息

侧向层析试纸条(LFS)具有操作简单、携带方便、检测快速等优点,并可用于实时检测和临床检测,因此得到了广泛的应用。金纳米材料的表面容易修饰,具有特殊的光学性质和一定的催化能力。利用金纳米材料的特性,将其作为信号分子应用于LFS上,建立了卡那霉素的检测方法。1.开发了基于适配体以及非巯基化核酸修饰的胶体金纳米探针,建立了一种新型的卡那霉素胶体金LFS。通过对试纸条组装各元件,尤其是对核酸适配体序的优化该试纸条对卡那霉素的肉眼分辨浓度为25 ng/m L,通过胶体金定量分析可以实现5 ng/m L-125ng/m L浓度范围内定量检测卡那霉素,其最低检出限为1.5 ng/m L。将该试纸条应用于蜂蜜中卡那霉素检测,其回收率可达到95.1%-105.2%。该试纸条具有灵敏度高、架构简单、选择性好、操作简单、重复性高等特点。2.设计了一种通用型的小分子适配体LFS,在不更换NC膜上固定的识别单元的情况下,可以对不同小分子进行检测。基于卡那霉素与适配体互补序列的竞争,能够快速、灵敏的检测出卡那霉素。通过对探针序列的优化,实现了对卡那霉素的高灵敏检测。该试纸条对卡那霉素的肉眼分辨浓度为15 ng/m L,通过胶体金定量分析可以实现5ng/m L-250 ng/m L浓度范围内定量检测卡那霉素,其最低检出限为0.3 ng/m L。此外,该方法还用于检测样品中的卡那霉素,其回收率可达到94%-103.8%,表明其具有一定的应用潜力。3.构建了一种新型的基于纳米模拟酶的信号放大LFS,实现了卡那霉素的快速、灵敏的检测。将A(GC)GC链修饰到Au NPs,通过络合作用结合Cu,因Cu具有较强的类过氧化物酶活性,因此增加了纳米金粒子的过氧化物酶活性。使用DAB作为氧化底物,对试纸条进行信号放大。通过肉眼识别卡那霉素的最低浓度为5 ng/m L,通过胶体金定量分析可以实现1 ng/m L-250 ng/m L浓度范围内定量检测卡那霉素,其最低检出限为0.08 ng/m L。将其应用于蜂蜜样品中的检测,回收率为95.3%-105.5%。

关键词：侧向层析试纸条卡那霉素金纳米颗粒适配体

产肠毒素大肠杆菌F5流行病学调查以及F5、F41双重RAA-LFD检测方法的建立

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产肠毒素大肠杆菌F5流行病学调查以及F5、F41双重RAA-LFD检测方法...

作者：刘平平内蒙古农业大学

学位级别：硕士

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致牛腹泻的主要细菌性病原,其中ETEC F5和F41引发的牛腹泻最为严重。掌握其流行特征,对感染的牛进行现场快速诊断至关重要。重组酶介导扩增技术(Recombinase Aid Amplifica... 详细信息

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致牛腹泻的主要细菌性病原,其中ETEC F5和F41引发的牛腹泻最为严重。掌握其流行特征,对感染的牛进行现场快速诊断至关重要。重组酶介导扩增技术(Recombinase Aid Amplification,RAA)是一种新型核酸等温扩增技术,通过与侧向层析试纸条(Lateral Flow Dipstick,LFD)联合,可以实现核酸检测可视化。针对ETEC F5、F41临床检测及防控需要,本论文主要进行了以下三个方面研究。1.呼和浩特市周边地区规模化牛场产肠毒素大肠杆菌F5流行情况调查随机采集呼和浩特市周边地区7个规模化牛场404份粪样和血样。采用PCR和ELISA方法进行检测。结果表明,404份粪样经PCR方法检测出64份阳性样品,阳性率为15.84%,404份血样中经ELISA方法检测出F5阳性135份,阳性率为33.42%,其中0～2月龄犊牛阳性率(17.82%)最高。综上,呼和浩特市规模化牛场F5的感染较严重,且高发于0～2月龄犊牛。2.产肠毒素大肠杆菌F5分离鉴定以及致病性研究对PCR检测阳性样品进行细菌分离培养;经分子生物学方法鉴定分离株;通过药敏试验评价F5的药物敏感性;对试验小鼠进行F5致病性研究。结果表明,通过细菌分离鉴定出8株F5菌株;F5分离株对β-内酰胺类、四环素类耐药,对氧氟沙星、亚胺培南、阿米卡星药物敏感;剖检感染F5死亡小鼠,可见肠道血肿、肝脏脾脏肿大淤血;数据分析可知F5对小鼠的半数致死量(LD50)为10CFU/m L。综上,F5分离株存在耐药情况且致病性强。3.产肠毒素大肠杆菌F5、F41双重RAA-LFD快速检测方法的建立根据F5、F41基因序列,分别设计特异性引物,建立能够识别产肠毒素大肠杆菌F5、F41双重RAA-LFD检测方法。在此基础上优化反应体系,进行灵敏度、特异性、临床样品的检测,以PCR作为平行对比评价双重RAA-LFD方法。结果表明,本试验在39℃反应20 min可实现F5、F41特异性扩增,检测灵敏度达2.5×10copies/μL。此外,临床样品检测中分析Kappa系数结果可知,RAA-LFD与PCR方法具有一致性。综上,本试验成功建立双重RAA-LFD检测方法,为临床检测ETEC F5、F41提供新方法。

关键词：产肠毒素大肠杆菌 F5 F41 重组酶介导扩增技术侧向层析试纸条

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吗啡免疫荧光层析快速定量方法的建立

中国药学杂志 2018年第16期53卷 1413-1418页

作者：刘佳胡小龙张玉荣卢建忠曾立波复旦大学上海200120 中国医药工业研究总院上海200040 上海市公安局物证鉴定中心上海市现场物证重点实验室上海200083

目的建立一种高灵敏度的检测方法对生物样本(血液、唾液和尿液)中吗啡进行快速定量。方法采用免疫层析试纸条的反应模式,以稀土元素铕荧光纳米颗粒为标记物,与吗啡单克隆抗体共价偶联,将吗啡抗原和羊抗鼠抗体包被于硝酸纤维素膜上分别... 详细信息

目的建立一种高灵敏度的检测方法对生物样本(血液、唾液和尿液)中吗啡进行快速定量。方法采用免疫层析试纸条的反应模式,以稀土元素铕荧光纳米颗粒为标记物,与吗啡单克隆抗体共价偶联,将吗啡抗原和羊抗鼠抗体包被于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,通过竞争性免疫抑制反应原理,结合干式免疫荧光检测仪用于生物样本中吗啡的快速定量。结果通过优化试验条件后制备得到免疫层析试纸条检测,线性范围在3~3 000 ng·m L^(-1);精密度和准确度吗啡质控品试验的RSD试纸条在37℃,7 d的加速试验中,性能没有明显降低。结论本实验初步建立的吗啡免疫荧光层析试纸条定量检测方法具有良好的线性范围和精密度,具有良好的特异性和稳定性。本方法可以快速便捷的对生物样本中吗啡进行定量检测,便于在基层单位推广使用。

关键词：吗啡免疫荧光层析法侧向层析试纸条法医毒物分析定量检测

基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价

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基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初...

作者：王丽萍中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

当前我国正处于消除血吸虫病的攻坚阶段,日本血吸虫病疫情整体处于极低水平,但境外输入性病例时有报道,迫切需要更加快捷、敏感的检测方法,用于病例诊断或风险识别。目的:结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合... 详细信息

当前我国正处于消除血吸虫病的攻坚阶段,日本血吸虫病疫情整体处于极低水平,但境外输入性病例时有报道,迫切需要更加快捷、敏感的检测方法,用于病例诊断或风险识别。目的:结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能简单、快速识别日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸的可视化检测技术,初步评价其对血吸虫中间宿主或终宿主感染早期的检测价值,并通过试剂、时间的折算,分析成本投入情况。方法:以日本血吸虫SjR2和SjG55A作为靶基因,结合Primer Premier 5软件及手工辅助设计引物,通过简易检出限、特异性确定引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以PCR方法为平行对照,评价建立检测方法的最低检出限、敏感性、特异性及不同终止方式检测结果。制备不同比例混合的阳性钉螺和阴性钉螺基因组,评价LFD-RPA方法的最低检出混合度。分别取毛蚴感染后不同时期钉螺样本,用解剖镜检法判断钉螺感染情况,提取钉螺样本DNA,评价LFD-RPA方法对钉螺不同感染阶段的血吸虫核酸检测能力,进行RPA、PCR的平行检测。LFD-RPA方法检测现场采集的钉螺样本,RPA、PCR为平行对照,评价LFD-RPA方法的检测效果。以曼氏血吸虫SmCOX1为靶基因,结合Primer Premier 5软件、手工辅助设计筛选引物,确定最终引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定最佳反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以文献中针对曼氏血吸虫Sm1-7基因设计的引物为基础,设计特异性探针,探索最佳反应温度及时间,建立LFD-RPA检测方法。以PCR为平行对照,评价建立方法的最低检出限及与特异性。建立40尾、80尾曼氏血吸虫尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（简称“40尾组”、“80尾组”）,并于感染后不同时间收集小鼠粪便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法进行平行检测,全面评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。随后,收集本实验室常用的血吸虫核酸检测生物学技术的基础数据,包括需要的试剂盒或主要试剂的具体名称、单盒价格、单盒反应次数以及来源。计算不同检测方法的每个样本投入成本,包括每个样本检测所需的试剂成本、劳动力成本。以每个样本投入试剂成本、劳动力成本为基础,在设置阴参、阳参的单个样本检测情况下,计算每次检测投入试剂成本、劳动力成本。同时,将96个反应作为不同检测方法批量检测总量。计算批量检测情况下,每个样本检测投入试剂成本、劳动力成本。并按照实验所需仪器数量将每种方法的技术要求划分为简单、一般、复杂、极复杂四个等级,对LFD-RPA和其他核酸检测方法的成本和技术要求进行比较分析。结果:成功建立了以日本血吸虫SjR2、SjG55A为靶基因的LFD-RPA检测方法以及以曼氏血吸虫SmCOX1、Sm1-7为靶基因的LFD-RPA检测方法,各方法的最优反应参数均为39℃、20min。冰上静置、滴加DNA提取液或酚氯仿三种终止LFD-RPA反应的方式对检测结果无影响。以SjR2、SjG55A为靶基因建立的LFD-RPA方法对含有日本血吸虫靶基因的质粒和成虫基因组最低检出限分别为1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,优于对应RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法与曼氏血吸虫、阳性双脐螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA均无交叉反应。SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA无交叉反应,但可检出曼氏血吸虫、阳性双脐螺,提示与曼氏血吸虫有交叉反应。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分别能最低检出2000只、1500只阴性钉螺中的1只阳性钉螺,最低检出混合度均高于对应RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可检出20组1:50的混合阳性钉螺,3中方法的敏感性均为100%。检测日本血吸虫实验室感染钉螺发现,血吸虫感染前6w的钉螺均镜检阴性,自7w出现镜检阳性钉螺,7～11w钉螺镜检阳性率分别为10%、30%、20%、40%、30%;SjR2-RPA在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、70%、50%、70%、60%、70%、60%、50%、20%、30%、70%、50%、50%、50%。SjR2-LFD-RPA 在钉螺感染后的1d、3d、5d、1～11w 的检测阳性率分别为 90%、80%、70%、70%、60%、60%、70%、70%、30%、30%、70%、50%、50%、50%。经统计学

关键词：日本血吸虫曼氏血吸虫重组酶聚合酶扩增侧向层析试纸条宿主

五种大豆种传植物检疫性病毒交叉引物扩增检测技术的研究与应用

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五种大豆种传植物检疫性病毒交叉引物扩增检测技术的研究与应用

作者：王道中国计量大学

学位级别：硕士

我国是世界第一大豆进口国,大豆的检验检疫格外重要。南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,To RSV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,Ar MV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)为频繁在口岸和海关截获的大豆种传植物检疫性病毒。随着国内、国际贸易的迅速发展,我国大豆进口量持续上升,大豆种传植物检疫性病毒随大豆进入我国的风险不断提高。因此,本研究针对这五种大豆种传植物检疫性病毒,利用交叉引物等温扩增技术建立了快速准确的检测方法,主要结果如下:根据SBMV、ToRSV、ArMV、TRSV和BPMV的外壳蛋白基因序列,分别设计并筛选各自CPA特异性引物,建立了一步法交叉引物等温扩增检测五种病毒的技术,该方法可以分别实现SBMV、To RSV、Ar MV、TRSV和BPMV的单重检测,具有良好的特异性。且该方法结合核酸试纸条检测SBMV的灵敏度为5 ng/μL总RNA,结合实时荧光检测SBMV的灵敏度为5×10 ng/μL总RNA;结合核酸试纸条的检测To RSV、Ar MV、TRSV和BPMV的灵敏度都为0.5 ng/μL总RNA,结合实时荧光检测To RSV、Ar MV、TRSV和BPMV的灵敏度分别为0.5 ng/μL、0.05ng/μL、5 ng/μL和0.05 ng/μL。本研究基于交叉引物等温扩增技术,分别建立了五种大豆种传植物检疫性病毒的等温扩增检测方法。这些检测方法可以在恒定温度条件下完成目的核酸片段的扩增,具有快速、特异、灵敏度高、操作简单等优点,避免了RCR等常规检测方法需要大型仪器、熟练的操作人员、检测成本高、耗费时间长等缺陷,在口岸检疫和现场快速检测领域具有重要的应用价值,对于保护大豆的进出口安全具有重要意义。

关键词：大豆植物检疫病毒交叉引物等温扩增侧向层析试纸条

基于金纳米颗粒的新型POCT传感器的研制与应用

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基于金纳米颗粒的新型POCT传感器的研制与应用

作者：吴泽暨南大学

学位级别：硕士

目的:制备新型的低成本的POCT(point-of-care testing)生物传感器,并将制作的POCT装置应用于多种分析物的检测。方法:制备两种新型POCT生物传感器:(1)将Hg能与胸腺嘧啶(T)共价结合形成稳定的T-Hg-T结构的特性及荧光淬灭技术应用于层析... 详细信息

目的:制备新型的低成本的POCT(point-of-care testing)生物传感器,并将制作的POCT装置应用于多种分析物的检测。方法:制备两种新型POCT生物传感器:(1)将Hg能与胸腺嘧啶(T)共价结合形成稳定的T-Hg-T结构的特性及荧光淬灭技术应用于层析试纸条,研制基于适配体的荧光淬灭层析试纸条(AFQ-LFS)用于检测Hg,并对其制作工艺及检测过程进行优化;(2)利用Pt@Au NPs能催化H2O2分解产生的O2推动毛细管中的液滴移动,设计并制作一种利用Pt@Au NPs的基于毛细管的可视化定量生物传感器(PI-VQCB)装置,对传感器制作方式进行了优化,并论证了其可行性和稳定性,然后通过使用相应的抗原抗体或适配体,制备双抗体夹心法PI-VQCB用于检测前列腺癌抗原(PSA)和癌胚抗原(CEA),制备竞争法PI-VQCB用于检测莱克多巴胺(Rac),制备双适配体夹心法PI-VQCB用于检测凝血酶。结果:建立了可检测水样中Hg的AFQ-LFS方法,荧光信号强度和检测物浓度呈正相关,其检测灵敏度是普通胶体金试纸条的约20倍,并可应用于实际江水水样的检测;成功建立了一种利用Pt@Au NPs的基于毛细管的可视化定量生物传感器(PI-VQCB)装置,并实现了对PSA、CEA、Rac和凝血酶的检测,最低检测限分别为0.014 ng/m L、0.44ng/m L、0.0556 ng/m L和0.0247 ng/m L,通过对多种靶标的检测,证明了这种新型PI-VQCB具有良好的适用性。在临床诊断及初筛、个性医疗、环境监测、食品安全检测等领域都具有较高的应用价值。

关键词： POCT 生物传感器适配体荧光淬灭侧向层析试纸条金纳米颗粒铂包金纳米颗粒毛细管

基于荧光量子点的荧光侧向层析试纸检测新方法建立

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基于荧光量子点的荧光侧向层析试纸检测新方法建立

作者：赵弟萍合肥工业大学

学位级别：硕士

(1)水溶性CdSe量子点的制备实验对CdSe量子点的合成时间,合成温度以及退火温度等因素做了简单初步的优化选择。结果显示合成时间的长短与合成温度的高低对CdSe量子点的半宽峰值和荧光谱峰峰位影响显著：较长合成时间较较短合成时间下生... 详细信息

(1)水溶性CdSe量子点的制备实验对CdSe量子点的合成时间,合成温度以及退火温度等因素做了简单初步的优化选择。结果显示合成时间的长短与合成温度的高低对CdSe量子点的半宽峰值和荧光谱峰峰位影响显著：较长合成时间较较短合成时间下生成的CdSe量子点的半宽峰值小,荧光谱图更加对称且较明显的红移,说明较长合成时间有利于CdSe量子点粒径的均一分布;从合成温度看,较高合成温度较较低合成温度下生成的CdSe量子点的半宽峰值明显减小,同样说明较高合成温度有利于CdSe量子点粒径的均一分布。(2)基于荧光量子点试纸条法快速检测三聚氰胺采用竞争法试纸条原理用基于量子点的荧光试纸条法快速检测三聚氰胺。结果表明该方法对三聚氰胺定量检测线性明显,特异性良好,检测时间短(只需5 mmin),上样体积少(只需70μL),检测灵敏度高,肉眼检测限能达10 ppb并可用于实际样品检测。此外,通过检测盐酸克隆特罗来进行实验方法稳定性的验证,结果表明该方法对盐酸克隆特罗检测线性明显,肉眼检测限能达到10 ppb。(3)凝血酶检测本实验通过建立量子点/胶体金之间的荧光共振能量转移体系并将其运用于侧向层析试纸条平台来实现对凝血酶的快速超灵敏检测。结果表明,该方法操作便捷,安全可靠,线性明显,特异性良好,检测速度快(只需6 min),上样体积少(只需80μL),检测灵敏度高,肉眼检测限可达0.135 nM,并可用于实际样品检测。

关键词：荧光纳米材料量子点侧向层析试纸条荧光标记物荧光共振能量转移