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为了研究小麦体细胞杂种渐渗系中γ-醇溶蛋白基因的组成及其与小麦育种的关系,我们利用基因组PCR技术从小麦Jinan177,十倍体长穗偃麦草,及它们的体细胞渐渗系杂种Ⅱ-12中分离了50个Y-醇溶蛋白基因序列。其中18个来自于杂种Ⅱ-12,双亲中各得到了16个序列。这些序列的长度在720-936 bp之间,相应的成熟多肽长度在239-309个氨基酸之间。这些成熟多肽的在一级结构上可以分为5个结构域。通过系统进化分析我们发现这些序列可以分为4个分枝。分枝1中只包含来源于杂种Ⅱ-12和亲本十倍体长穗偃麦草的序列,这可能暗示部分长穗偃麦草Y-醇溶蛋白基因渐渗到小麦体细胞杂种Ⅱ-12中。分枝3中包含5个亲本济南177和5个杂种Ⅱ-12中的序列,这说明杂种Ⅱ-12体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12中可能仍然含有母本小麦的Gli-1位点。以杂种Ⅱ-12为模板得到的序列中编码乳糜泄病抗原决定簇含量大大低于双亲序列。同时,我们从小麦体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12分离了13个低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）基因序列。其中4个序列内部包含终止密码子,可能为假基因,另外9个序列包含完整的开放阅读框。通过序列比对发现这些序列的蛋白一级结构与从亲本中得到的LMW-GS序列类似,但也含有一些自身特点。系统进化分析表明,杂种Ⅱ-12中的序列与亲本济南177和其他小麦族来源的基因聚在一起。选取其中两个序列1-50（包含额外半胱氨酸残基）和1-94（较长重复区）进行了原核表达,纯化及配粉和揉面实验来研究这两个基因的功能特性。实验结果证明1-50与1-94面粉品质具有一定的负效应。长穗偃麦草是改良栽培小麦的重要物种之一,其高分子和低分子量麦谷蛋白对改良小麦面粉的品质作用重大。我们通过PCR方法以二倍体长穗偃麦草的基因组DNA为模板,获得了14个低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）基因序列。其中11个序列包含完整开放阅读框,通过比对发现这11个基因的蛋白一级结构与小麦以及小麦近缘禾草的Glu-3位点的基因非常相似。所有11个序列都含有一个14个氨基酸（MESNIIISFLK/RPWL）的N端区域,根据成熟蛋白的第一个氨基酸为M,我们将这11个蛋白归为m-型低分子量麦谷蛋白亚基。通过系统进化树分析,结果发现来源于二倍体长穗偃麦草的基因聚在一起并且与中间偃麦草来源的3个基因进化关系较近,而与十倍体长穗偃麦草来源的基因进化关系较远。其中一个基因Ee34的氨基酸序列中含有额外的半胱氨酸残基,我们将此序列进行原核表达、纯化及配粉和揉面实验来研究其功能特性,实验结果表明,添加Ee34后的生面团的面团特性得到显著提高。

关键词：小麦长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系谷醇溶蛋白面团功能特性

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α-醇溶蛋白与小麦育种

α-醇溶蛋白与小麦育种

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作者：陈梦竹山东大学

学位级别：硕士

为了研究α-醇溶蛋白基因组成及其与小麦育种的关系,我们利用基因组PCR技术分离了158个α-醇溶蛋白基因的编码序列。其中,从二倍体长穗偃麦草(diploid Agropyron elongatum)和老芒麦(Elymus sibiricus)中获得63个α-醇溶蛋白基因的开放... 详细信息

为了研究α-醇溶蛋白基因组成及其与小麦育种的关系,我们利用基因组PCR技术分离了158个α-醇溶蛋白基因的编码序列。其中,从二倍体长穗偃麦草(diploid Agropyron elongatum)和老芒麦(Elymus sibiricus)中获得63个α-醇溶蛋白基因的开放阅读框(ORFs),这些序列中90%存在内部终止密码子或移码,前者主要是由于编码谷氨酰胺的密码子(CAG或CAA)发生了碱基C到T的颠换变为终止密码子(TAG或TAA)。通过分析α-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列发现α-醇溶蛋白是由N-端信号肽,N-端重复区,第一个多聚谷氨酰胺区,N-端非重复区,第二个多聚谷氨酰胺区和C-端非重复区六部分组成,其中除了两个变异较大的多聚谷氨酰胺区外,其他区域比较保守且序列间相似性较大:其差异主要归因于单核昔酸多态性(SNPs)、序列中的密码子的改变或移码突变。在重复区的前三个密码子中,我们发现了一些新的基序,例如GRV和RV;在第一个多聚谷氨酰胺区出现了(Q)AR(Q),(Q) AR(Q)和(Q)A新基序;我们也发现一些具有奇数个半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,并且非保守的半胱氨酸残基在N-和C-末端非重复区都存在。在二倍体长穗偃麦草的假基因中发现了一种已知的乳糜泻疾病(CD)抗原决定簇;在老芒麦的真基因中发现了两种CD抗原决定簇。系统进化树的分析表明,来自于二倍体长穗偃麦草的α-醇溶蛋白基因由若干个亚家族组成,与十倍体来源的基因聚在一起;而来自于老芒麦的α-醇溶蛋白基因则与小麦属的α-醇溶蛋白基因彼此之间具有更高的序列相似性。同时,我们从小麦体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及其亲本普通小麦JN177和十倍体长穗偃麦草中分离了95个α-醇溶蛋白基因的ORFs。序列比对的结果表明杂种Ⅱ-12中α-醇溶蛋白基因的组成和来源如下:(1)杂种中大多数α-醇溶蛋白基因和IN177α-醇溶蛋白基因相似;(2)小部分来自于十倍体长穗偃麦草的渐渗;(3)一些新的基因是由点突变、不等交换或者亲本基因的复制滑动所造成的。因此,我们证实了新的α-醇溶蛋白基因可能通过体细胞杂交而更快的产生,这种产生的方式与HMW-GS自然进化的机制是一致的。进一步氨基酸序列分析表明,在亲本小麦JN177和Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因中鉴定出了四种已知类型的CD抗原决定簇,在十倍体长穗偃麦草中只发现一种。值得注意的是虽然有相同的四种类型的CD表面抗原决定簇,但是杂种Ⅱ-12中编码CD表面抗原决定簇序列的基因数量要低于JN177,特别是在假基因中则更低。文章讨论了体细胞杂种α-醇溶蛋白与小麦育种的关系。 α-醇溶蛋白中半胱氨酸的数目和位置影响面粉的品质,因此,我们选择了两个与面粉品质具有潜在相关性的基因,一个来自于老芒麦,另一个来自于Ⅱ-12,对其进行原核表达,然后构建了基于ubiquitin启动子的真核表达载体pCAMBIA3301-E42和pCAMBIA3301-Ⅱ-93,接着运用农杆菌介导的转化方法分别转化小麦株系,通过双引物PCR筛选后,初步获得了19株阳性株系,为进一步的分子鉴定、遗传分析、功能鉴定和育种应用奠定基础。从Ⅱ-12中克隆的H1Dx5基因是一个潜在的优质HMW-GS基因,利用胚乳特异的Bxl7启动子构建了该基因的真核表达载体pBIN20-H1Dx5,为今后该基因功能研究和应用于小麦育种打下了基础。

关键词：普通小麦十倍体长穗偃麦草二倍体长穗偃麦草老芒麦体细胞杂种渐渗系 α-醇溶蛋白基因新基因产生真核转化小麦育种

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ω-醇溶蛋白基因的克隆及通过RNAi抑制小麦α-醇溶蛋白基因家族表达研究

ω-醇溶蛋白基因的克隆及通过RNAi抑制小麦α-醇溶蛋白基因家族表...

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作者：杨亮山东大学

学位级别：硕士

小麦醇溶蛋白主要赋予面粉的粘性。目前,已从普通小麦（Triticum aestivum）中克隆了大量的α-、γ-醇溶蛋白基因,但是已克隆的ω-醇溶蛋白基因数量还很少。根据小麦属ω-醇溶蛋白基因设计了一对简并引物,以体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及其... 详细信息

小麦醇溶蛋白主要赋予面粉的粘性。目前,已从普通小麦（Triticum aestivum）中克隆了大量的α-、γ-醇溶蛋白基因,但是已克隆的ω-醇溶蛋白基因数量还很少。根据小麦属ω-醇溶蛋白基因设计了一对简并引物,以体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及其亲本小麦Jinan 177和十倍体长穗偃麦草的gDNA为模板,扩增得到了16个ω-醇溶蛋白基因序列,长度变化为924～1146bp。其中,6个序列中因为含有编码框内提前终止密码子,因此可能是假基因。这些序列与已知的ω-醇溶蛋白基因序列有高度的相似性。通过分析ω-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列发现ω-醇溶蛋白由两侧短的N-端与C-端保守区及中间长重复可变区组成。系统进化分析表明这些ω-醇溶蛋白基因聚为三个亚家族：第一个包括来源于5个长穗偃麦草和1个Ⅱ-12的序列,表明至少有一个长穗偃麦草ω-醇溶蛋白基因通过体细胞杂交渗入Ⅱ-12中;第二个包括3个来自Ⅱ-12和6个来自于Jinan177的序列,它们都属于ARQ/E型ω-醇溶蛋白基因;第三个由三个来自于普通小麦的SRL型ω-醇溶蛋白基因组成。我们还发现,来自于第二亚家族的Ⅱ-12的一个ω-醇溶蛋白基因在其C端有一个Cys位点,这可能使其与面粉品质相关。所以我们预测,通过体细胞渐渗的方式使得杂种Ⅱ-12产生了新的ω-醇溶蛋白基因。乳糜泻（coeliac disease）是患者进食麦类食品后,对其中的醇溶谷蛋白不耐受而引起的慢性小肠吸收不良综合症,而α-醇溶蛋白含有大量可导致乳糜泻疾病的毒性肽段。本论文通过对已发布的α-醇溶蛋白基因进行聚类,找出它们保守性较强的片段,根据本实验室得到的一个来自于体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因设计引物,经PCR扩增得到保守性片段作为干扰α-醇溶蛋白基因家族的出发序列,并构建了RNA干扰真核表达载体p3301-Ubi-AR12与p3301-Ubi-AR34。通过农杆菌介导的转化方法,分别将上述两个载体转化小麦株系,经PCR筛选后,初步得到了30株阳性株系。利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分别对这三十株阳性株系的种子进行了醇溶蛋白组成的分析检测,发现其中有六株籽粒表现出明显的α-醇溶蛋白干扰现象。为进一步研究RNA干扰是否对植株的高、低分子量谷蛋白亚基产生影响,我们通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述六株产生RNA干扰效应的植株进行分析,发现它们的HMW-GS组成与对照相比没有发生改变,而LMW-GS发生了一定程度的改变。这为进一步研究RNA干扰技术在小麦谷蛋白的功能提供了理论基础。

关键词：普通小麦十倍体长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系 ω-醇溶蛋白基因 α-醇溶蛋白 RNA干扰

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