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作者：胡健健集美大学

学位级别：硕士

鲍鱼作为中国传统名贵海产品,一直受到人们的喜爱。随着我国经济快速增长以及人们生活水平的提高,鲍鱼的需求量不断增加,同时,也带动了鲍鱼养殖业的蓬勃发展。但是,海水污染、高密度养殖等因素导致鲍鱼疾病时常发生,造成巨大的经济损失... 详细信息

鲍鱼作为中国传统名贵海产品,一直受到人们的喜爱。随着我国经济快速增长以及人们生活水平的提高,鲍鱼的需求量不断增加,同时,也带动了鲍鱼养殖业的蓬勃发展。但是,海水污染、高密度养殖等因素导致鲍鱼疾病时常发生,造成巨大的经济损失。鲍鱼病害的防治已成为鲍鱼养殖业中亟待解决的问题,其中,副溶血弧菌一直是鲍鱼养殖的主要病原。先天免疫是鲍鱼抵抗病原侵袭的主要途径。因此,深入探索参与鲍鱼先天性免疫反应的关键基因和蛋白的功能对于解决鲍鱼病害具有特别重要的意义。前期研究提示,丝氨酸蛋白酶在鲍鱼先天免疫中扮演重要的角色。本研究根据其他软体动物丝氨酸蛋白酶基因的保守序列设计特异性引物,采用巢式PCR和RACE技术从皱纹盘鲍的肝脏组织克隆获得了丝氨酸蛋白酶(Haliotis discus hanai serine proteinase,Hdh-SP)基因c DNA全长序列,序列分析结果显示Hdh-SP c DNA全长共1107 bp,包含5’UTR 111 bp,3’UTR 39 bp,ORF 957 bp,编码319个氨基酸残基。通过序列比对结果显示,该氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、栉孔扇贝(Azumapecten farreri)、缢蛏(Sinonovacula constricta)和马氏珠母贝(Pinctada fucata)中丝氨酸蛋白酶的同源性分别为54%、50%、47%和40%。Hdh-SP基因编码蛋白的预测相对分子质量为34.0 k Da,理论等电点为6.89,属于亲水蛋白,预测其N-末端为信号肽。该蛋白的二级结构以延伸链和无规卷曲为主,其中α-螺旋占15.72%,无规卷曲占50.63%,延伸链占33.65%。根据系统发育关系分析Hdh-SP与太平洋牡蛎丝氨酸蛋白酶具有较高的保守性并且亲缘关系最近。构建了原核重组表达载体p ET28a-SP,使用原核表达系统表达并纯化出重组Hdh-SP,用于制备兔抗鲍鱼丝氨酸蛋白酶的多克隆抗体。构建昆虫细胞重组表达载体,利用昆虫-杆菌表达系统表达出可溶的Hdh-SP,SDS-PAGE显示其分子量为30 k Da,与预测的分子量大小相吻合,Western blot结果显示兔抗鲍鱼丝氨酸蛋白酶的多克隆抗体与Hdh-SP有很好的的免疫杂交反应,且大部分位于胞浆内。使用荧光定量PCR与Western blot技术检测Hdh-SP在鲍鱼血淋巴、肝胰腺、肌肉、性腺、鳃、外套膜等组织的基因和蛋白水平的表达情况。结果显示,肝胰腺组织中Hdh-SP基因水平和蛋白水平的表达量明显高于其他组织。用副溶血弧菌侵染鲍鱼之后,其血淋巴细胞内Hdh-SP基因水平与蛋白水平都有不同程度上调,因此推断Hdh-SP参与鲍鱼免疫反应。同时,用副溶血弧菌刺激鲍鱼之后,发现与鲍鱼免疫密切相关的四个免疫因子细胞凋亡酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8,Caspase 8)、异体移植炎症因子(Allograft inflammatory factor,ALIn Fa)、巨噬细胞表达蛋白(macrophage expressed protein,MEP)、转录因子(Nuclear factorκB,Rel/NF-κB)在血淋巴细胞内不同程度明显上调,说明这四个免疫因子参与到副溶血弧菌侵染后的免疫反应中。为了进一步了解Hdh-SP在免疫调节方面的作用,采用RNAi技术沉默Hdh-SP基因。结果显示,Hdh-SP的表达被抑制后,Rel/NF-κB、MEP、ALIn Fa和Caspase 8这四个免疫因子基因的相对表达量都会不同程度下降,提示在鲍鱼免疫反应中,Hdh-SP可能是通过调控免疫因子的表达来参与免疫调节。鲍鱼血淋巴细胞凋亡检测结果表明当Hdh-SP基因表达受到抑制后,血淋巴细胞的凋亡比例明显下降,说明Hdh-SP通过调控Caspase 8基因的表达而参与调控鲍鱼血淋巴细胞凋亡。本论文围绕Hdh-SP在鲍鱼先天性免疫反应中的作用展开研究。结果显示,副溶血弧菌侵染皱纹盘鲍后,Hdh-SP基因与蛋白水平显著上调表达。Hdh-SP通过促进Rel/NF-κB基因表达,启动下游MEP、ALIn Fa和Caspase 8基因的转录从而调节免疫反应来抵御致病菌入侵。本文的研究结果对于理解鲍鱼的先天性免疫反应具有重要意义,也为鲍鱼疾病的防治策略提供了理论参考。

关键词：皱纹盘鲍丝氨酸蛋白酶基因克隆体外表达荧光定量PCR RNAi干扰

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骨碎补总黄酮对小鼠成骨细胞中骨保护素和核因子-κB受体活化因子配体mRNA体外表达的影响

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中国兽医杂志 2009年第12期45卷 24-26页

作者：王建舫安亚兰张大丙张国中曾兴梅穆祥韩博中国农业大学动物医学院北京海淀100193 北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室北京昌平102206

骨碎补总黄酮是由水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎中提取的有效成分,试验证明,骨碎补总黄酮能够促进成骨细胞增殖[1],抑制破骨细胞成熟分化.

关键词： mRNA表达核因子-κB 成骨细胞活化因子骨保护素总黄酮骨碎补体外表达

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人巨细胞病毒潜伏相关IL-10基因克隆及体外表达

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中国细胞生物学学报 2010年第3期32卷 422-428页

作者：郑晓群冯晶晶曾智姜招嫦季敬璋李祥吕建新温州医学院附属第二医院实验诊断中心温州325027 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035

为了研究人巨细胞病毒潜伏相关白细胞介素-10(LA-cmvIL-10)及巨细胞病毒编码的白细胞介素-10(cmvIL-10)在病毒感染中的作用,构建了cmvIL-10基因和LA-cmvIL-10基因的原核及真核表达体系。从患儿尿液标本中提取病毒DNA,应用重叠延伸PCR扩... 详细信息

为了研究人巨细胞病毒潜伏相关白细胞介素-10(LA-cmvIL-10)及巨细胞病毒编码的白细胞介素-10(cmvIL-10)在病毒感染中的作用,构建了cmvIL-10基因和LA-cmvIL-10基因的原核及真核表达体系。从患儿尿液标本中提取病毒DNA,应用重叠延伸PCR扩增cmvIL-10基因和LA-cmvIL-10基因外显子,产物克隆至原核表达载体pMal-c2x和真核表达载体pCDNA3.1上,测序显示扩增的cmvIL-10基因和LA-cmvIL-10基因外显子包含了完整的编码区;重组的原核表达质粒pMal-c2x-cmvIL-10和pMal-c2x-LAcmvIL-10转化受体菌E.coli BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在受体菌内表达目的蛋白。将表达产物免疫家兔,获得特异性抗血清。真核表达载体pCDNA3.1-cmvIL-10和pCDNA3.1-LAcmvIL-10转染Hela细胞,经Western blot鉴定与设计相符。

关键词：人巨细胞病毒潜伏白细胞介素-10 克隆体外表达

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重组变异纤维蛋白原体外表达及对凝血功能的影响

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天津医药 2002年第7期30卷 420-423页

作者：毛用敏平立芳程津新陈倩赵福梅赵炳让崔让庄天津市心血管病研究所 300051

目的:采用基因重组技术和细胞培养方法制备纤维蛋白原（Fbg）β链K 318E/D 320 S变异蛋白,观察此变异蛋白对凝血反应的影响。方法:用Site-directed mutagenesis方法构建变异重组质粒;磷酸钙法将此质粒转染CHO细胞;经细胞培养表达变异蛋... 详细信息

目的:采用基因重组技术和细胞培养方法制备纤维蛋白原（Fbg）β链K 318E/D 320 S变异蛋白,观察此变异蛋白对凝血反应的影响。方法:用Site-directed mutagenesis方法构建变异重组质粒;磷酸钙法将此质粒转染CHO细胞;经细胞培养表达变异蛋白;硫酸铵沉淀法和免疫亲和层析法获取蛋白。进行纤维蛋白多肽A、B释放实验和在3种Ca2+浓度下的纤维蛋白聚合实验,并评价此变异蛋白的功能。结果:变异与正常Fbg纤维蛋白多肽A、B释放实验无差异。纤维蛋白聚合实验显示,在不同Ca2+条件下两者间Lag period,Vmax和最终光密度均有显著性差异（P<0.05）。结论:B　β链变异蛋白可能引起Fbg D区结构的变化,使纤维蛋白聚合位点和Ca2+结合位点不能发挥正常功能,致使纤维蛋白聚合反应速度减慢及纤维蛋白纤维粗细出现异常。

关键词：重组变异纤维蛋白原体外表达凝血功能影响

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新孢子虫致密颗粒蛋白截短型NcGRA7t的体外表达及免疫活性检测

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畜牧与兽医 2012年第12期44卷 57-59页

作者：金春梅于龙政张守发延边大学农学院动物医学系

为构建新孢子虫致密颗粒截短型NcGRA7t基因的原核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况和免疫活性,运用PCR方法和基因克隆技术,构建了pGEX-4T3-NcGRA7t重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋... 详细信息

为构建新孢子虫致密颗粒截短型NcGRA7t基因的原核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况和免疫活性,运用PCR方法和基因克隆技术,构建了pGEX-4T3-NcGRA7t重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白在体外的表达情况和免疫活性。结果显示:以新孢子虫的cDNA为模板,从新孢子虫Nc-1株扩增出了NcGRA7t基因,并克隆到了表达载体上。本试验成功构建了重组表达质粒pGEX-4T3-NcGRA7t,表达出的NcGRA7t重组蛋白具有免疫活性,为新孢子虫病的流行病学调查和亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：新孢子虫 NcGRA7t 体外表达免疫活性

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含有AP2结构域的一个陆地棉GhDREB转录因子的特性及体外表达

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棉花学报 2002年第Z1期14卷 62-63页

作者： Xian-guo CHENG Department of Biological Science and Biotechnology Tsinghua University 100084 Beijing China

　　Abiotic stress including drought, low temperature, ABA and high salt is major factor affecting the plant growth. Isolation and functional study of abiotic stress-related gene will be helpful to elucidate the signal transduction mechanism of the target gene under abiotic stress during the growth of plant. By using gene-transfer technique, the target gene is incorporated into the plant to improve the adaptation of plant to abiotic stress.　　……

关键词：结构域陆地棉转录因子特性体外表达 Gossypium hirsutum abiotic stress target gene signal transduction functional study plant growth the growth

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RT-qPCR检测双峰驼体内CYP2J基因的分布与表达及其体外表达载体的构建

RT-qPCR检测双峰驼体内CYP2J基因的分布与表达及其体外表达载体的...

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作者：张立群内蒙古农业大学

学位级别：硕士

为探明CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达分布情况以及进一步为揭示CYP2J基因与双峰驼抗盐敏感性高血压生物学特性的相关性提供线索,本研究采用实时荧光定量PCR法从mRNA层面检测CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达量,并构建双峰驼CYP2J基... 详细信息

为探明CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达分布情况以及进一步为揭示CYP2J基因与双峰驼抗盐敏感性高血压生物学特性的相关性提供线索,本研究采用实时荧光定量PCR法从mRNA层面检测CYP2J基因在双峰驼各组织中的表达量,并构建双峰驼CYP2J基因的体外表达载体,为后续的蛋白层面的研究奠定基础。根据GenBank中登录的双峰驼CYP2J预测序列(XM06187584)设计引物,选用ACTB作为内参基因,利用SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,采用2-ΔΔCT相对定量法处理数据,从基因层面上对双峰驼肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、血管、胰腺等8种组织的CYP2J基因及羊肝脏CYP2J基因的表达量进行检测。结果表明CYP2J基因在双峰驼体内以心脏表达量最高,其表达量显著高于羊肝脏(P表达量极低。本研究应用RT-PCR方法扩增出双峰驼CYP2J mRNA的全长1509bp的完整CDs区,胶回收纯化后,进行TA克隆,使目的基因先连于pMD-18T中并转化于大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。经HindⅢ和Kpnl双酶切和质粒PCR鉴定后,扩大培养,并用上述内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CYP2J后,连接于经同样的双酶切的原核表达载体pET-32a,同样转化于大肠杆菌DH5α细胞中鉴定阳性克隆,并经HindⅢ和KpnⅠ双酶切、质粒PCR鉴定及测序鉴定重组质粒是否构建成功。结果表明,在重组质粒pMD18-T-CYP2J和pET-32a-CYP2J双酶切电泳图中均能显示约1500bp的特异性目的条带以及分别于2700bp和5900bp处显示2种质粒的特异条带;以2种重组质粒为模板进行PCR扩增后电泳图均在约1500bp处显示CYP2J特异性条带;并且将测序结果与Genbank中公布的序列进行比对,其相似度为99%。以上结果证明双峰驼CYP2J原核表达载体pET-32a-CYP2J构建成功。因此,通过本实验从RNA层面初步揭示了CYP2J基因在双峰驼主要8种组织内的表达与分布,并成功构建了该基因的原核表达载体,为后续的蛋白层面研究奠定了基础。

关键词：双峰驼 CYP2J 实时荧光定量PCR 体外表达载体构建

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反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

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上海第二医科大学学报 2004年第8期24卷 600-602页

作者：吴娟娟王丹茹陆峻泓刘伟刘德莉曹谊林张涤生上海第二医科大学第九人民医院整复外科上海市组织工程研究中心上海200011

目的构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体,探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法用DNA直接克隆连接的方法,构建反义Smad3腺病毒重组质粒,再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维... 详细信息

目的构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体,探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法用DNA直接克隆连接的方法,构建反义Smad3腺病毒重组质粒,再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录。结果经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达。结论所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达,可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究。

关键词：反义Smad3 腺病毒基因表达载体体外表达成纤维细胞基因治疗

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酿酒酵母Sfil功能性多肽的体外表达与分析

酿酒酵母Sfil功能性多肽的体外表达与分析

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作者：柴丽娜郑州大学

学位级别：硕士

Sfi1蛋白是与酿酒酵母细胞周期密切相关的一种蛋白,其主要功能是维持细胞分裂过程中纺锤体的正确装配,在细胞分裂、细胞形态维持等方面具有重要的作用,但是迄今鲜有文献从分子水平对Sfi1蛋白结构与功能进行系统研究。Sfilp具有21个LLX3F... 详细信息

Sfi1蛋白是与酿酒酵母细胞周期密切相关的一种蛋白,其主要功能是维持细胞分裂过程中纺锤体的正确装配,在细胞分裂、细胞形态维持等方面具有重要的作用,但是迄今鲜有文献从分子水平对Sfi1蛋白结构与功能进行系统研究。Sfilp具有21个LLX3F/LX2W模式的内部重复序列,以及20个间隔序列,位于该蛋白的中央区域。Sfilp中央区域的功能主要在于,通过内部重复序列结合酵母中心体蛋白Cdc31p,从而作用于SPB的复制过程。然而,Sfilp的氨基端与羧基端区域虽不含有内部重复序列,但是生物信息学分析发现,Sfilp的羧基端存在七个,氨基端存在两个可能的细胞周期蛋白依赖激酶Cdc28的保守磷酸化位点;同时酵母细胞水平发现,将其缺失会导致细胞分裂出现异常,在调控SPB的复制功能上起关键性作用。因此对Sfi1蛋白的深入研究,本课题重点是从其功能性多肽的研究角度来切入,其中包括对内部保守多肽和两端的磷酸化多肽的分析。本论文从两个方面来阐述对酿酒酵母Sfilp功能性多肽的研究,一方面通过对其内部21个保守多肽的同源分析,发现第20个保守多肽具有研究代表性,我们针对此段多肽构建肽库,其中包括野生型,定点突变型以及随机突变型Sfi1多肽,来研究突变对Sfi1多肽与中心体蛋白Cdc31p相互作用的影响,以及对Sfilp生物学功能的影响;一方面针对Sfilp氨基端和羧基端的磷酸化多肽进行体外表达,为后期的体外磷酸化研究奠定基础。本实验通过计算机同源模建来比对位于第20个保守多肽上的定点突变型Sfi1多肽,即Sfi1p-763的三维构象,将此位置的氨基酸进行随机突变,发现L763H的末端构象稍有差异,a-螺旋较为舒展,然后利用常规PCR技术及融合PCR技术,分别扩增得到SFIl野生型及定点突变型的基因序列,再利用酵母表面展示技术,在酵母细胞中诱导表达Sfi1多肽,发现其诱导表达的最佳条件为诱导温度20℃,乳糖浓度0.02g/ml,诱导时间24h。通过SDS-PAGE检测,发现Sfi1p定点突变L763H并没有影响Sfi1多肽与Cdc31p的相互作用。而通过流式细胞检测DNA含量发现,L763H使细胞周期停滞在G2/M期,并且影响酵母细胞的生长状态。本实验还采用错误倾向PCR技术,扩增得到Sfi1多肽的编码基因库;将编码基因克隆至表面展示载体,获得Sfi1多肽表达载体库;将表达载体库转化酵母细胞,诱导表达多肽,获得Sfi1多肽肽库,并通过SDS-PAGE检测Sfi1随机突变多肽与Cdc31p的相互作用。此外,通过常规PCR技术扩增得到sFIl-N端和C端基因序列,构建至蛋白表达载体pET上,在大肠杆菌BL21细胞中,使用诱导剂IPTG对Sfilp-N端和C端多肽进行体外诱导表达,其中Sfilp-N端多肽诱导表达的最佳条件是：诱导温度为25℃,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为4h:Sfilp-C端多肽诱导表达的最佳条件是诱导温度为30℃,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为8h.Sfilp-N端和C端磷酸化多肽成功地体外表达,为研究Sfilp-N端和C端的磷酸化机制奠定了基础。

关键词：酿酒酵母 Sfi1p 保守多肽磷酸化多肽体外表达蛋白质相互作用

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利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

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中国临床药理学与治疗学 2005年第6期10卷 701-704页

作者：罗平许波鲁永玲周红第三军医大学药理教研室重庆400038

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapidtranslationsystem)对其进行表达。方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段... 详细信息

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapidtranslationsystem)对其进行表达。方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E.coli)裂解产物中进行表达。应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定。结果:pIVEX2.3G重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500可表达出分子量约为14.4的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论:抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达。

关键词：葛佬素抗菌肽快速翻译系统体外表达 PCR

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