检索结果-南通市图书馆

中国生物制品学杂志 2024年第1期37卷 32-36页

作者：唐琪刘宏博张哲罡张家友曹慧杨晓明武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207 国家联合疫苗工程技术研究中心湖北武汉430207 北京生物制品研究所有限责任公司质量保证部北京100029 中国生物技术股份有限公司北京100029

目的利用真核生物mRNA成熟过程中内含子外显子置换(permuted intron exon,PIE)策略,构建可在体外环化(in vitro cyclization,IVC)并具有翻译功能的RNA,转染HEK-293T细胞后进行表达。方法选取具备Ⅰ型催化内含子(groupⅠcatalytic intron... 详细信息

目的利用真核生物mRNA成熟过程中内含子外显子置换(permuted intron exon,PIE)策略,构建可在体外环化(in vitro cyclization,IVC)并具有翻译功能的RNA,转染HEK-293T细胞后进行表达。方法选取具备Ⅰ型催化内含子(groupⅠcatalytic intron)的5’和3’环化臂、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)以及目的基因序列构建模板质粒,通过PCR法获得线性化质粒模板,经体外转录(in vitro transcription,IVT)合成线性RNA,依次添加环化试剂完成IVC得到环状RNA(circular RNA,circRNA)。采用琼脂糖凝胶电泳及核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化的方式确认RNA环化。将分别携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)及流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)(IVR-180)的circRNA转染HEK-293T细胞,逐一验证其体外表达情况。结果RNA环化后电泳主条带变小,且出现环化产生的小片段,经RNase R消化,仅环化后RNA条带仍有部分保留。转染EGFP-circRNA的HEK-293T细胞荧光显微镜下可见明显绿色荧光;转染Fluc-circRNA的HEK-293T细胞Fluc表达值平均为未环化RNA的20倍以上,且随Fluc-circRNA转染剂量的升高,荧光数值(relative light unit,RLU)呈上升趋势;Western blot分析显示,转染HAcircRNA的HEK-293T细胞成功表达了HA蛋白。结论在体外成功环化了线性RNA并完成不同蛋白的表达,为新型流感疫苗及mRNA疫苗的研究奠定了基础。

关键词：环状RNA 体外环化绿色荧光蛋白萤火虫荧光素酶流感病毒血凝素

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调节circRNA内的miRNA结合位点以提高其翻译效率

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中国科学技术大学学报 2023年第9期53卷 39-50,66,67页

作者：张可维单革陈亮中国科学技术大学附属第一医院检验科中国科学院天然免疫与慢性疾病重点实验室中国科学技术大学生命科学与医学部基础医学院安徽合肥230027

环状RNA(circRNA)是具有共价闭合的环状结构的RNA,其中有些circRNA具有翻译能力。然而,调节circRNA翻译效率的方法及其应用仍需我们进一步探索。本文利用T7 RNA聚合酶和优化的PIE方法,转录形成含有CVB3 IRES翻译起始元件和荧光素酶蛋白... 详细信息

环状RNA(circRNA)是具有共价闭合的环状结构的RNA,其中有些circRNA具有翻译能力。然而,调节circRNA翻译效率的方法及其应用仍需我们进一步探索。本文利用T7 RNA聚合酶和优化的PIE方法,转录形成含有CVB3 IRES翻译起始元件和荧光素酶蛋白编码序列的RNA,并在体外环化形成环状RNA。我们将环状RNA转染到细胞中,并成功翻译成具有活性的荧光素酶。在荧光素酶编码序列两侧插入miRNA结合位点显著降低了circRNA的翻译效率。随后萤火虫荧光素酶编码序列中的miRNA结合位点的同义突变导致体外合成的circRNA翻译效率增加。我们还证明了特定miRNA结合位点的突变也可以增强合成circRNA的翻译效率。进一步的体内实验通过生物发光成像表明,miRNA结合位点的同义突变促进了体外合成circRNA在体内的翻译。本研究表明,调节circRNA内的miRNA结合位点影响了circRNA的翻译效率,这有望作为未来临床成像应用的多功能工具。

关键词：环状RNA 环状RNA翻译体外环化微小RNA 环状RNA应用

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环状RNA:从生物发生到医学治疗

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中国医药导刊 2023年第1期25卷 21-27页

作者：蒋凯周蓉曾晶高璐园因(北京)生物科技有限公司北京100056

环状RNA(CircRNAs)是一类单链共价闭环RNA,在真核细胞中由反向剪接形成。CircRNAs作为microRNA海绵,蛋白海绵,转录和翻译调节因子,在各种疾病相关的信号传导通路中发挥着重要作用。类似于mRNA和siRNA,CircRNAs作为现代医学新疗法的潜力... 详细信息

环状RNA(CircRNAs)是一类单链共价闭环RNA,在真核细胞中由反向剪接形成。CircRNAs作为microRNA海绵,蛋白海绵,转录和翻译调节因子,在各种疾病相关的信号传导通路中发挥着重要作用。类似于mRNA和siRNA,CircRNAs作为现代医学新疗法的潜力已经被广泛探索。最近,尤其是在应对新冠肺炎疫情,mRNA疫苗的安全性和预防严重症状的有效性已被证实。但是,mRNA相对短的半衰期限制了其在更广泛的治疗领域当中的应用。相对而言,CircRNAs缺乏外切核酸酶介导的降解所需的游离端,因而显示出更强的体内持久性。此外,溴化氰化学法、RNA或者DNA连接酶法、以及自剪切内含子的核酶法,都可能被优化成为高度有效的体外环化方法。CircRNAs因其生物功能的重要性和技术可行性,正在成为一种极具潜力的治疗方法。本研究将系统阐述CircRNAs生物发生、生物学功能、体外环化及潜在的应用,以期为进一步研究CircRNAs提供借鉴。

关键词：环状RNAs 反向剪接内部核糖体进入位点体外环化 RNA疗法

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基于大规模PCR生产线性DNA及重组酶介导的线性DNA环化研究

基于大规模PCR生产线性DNA及重组酶介导的线性DNA环化研究

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作者：王飞湖北大学

学位级别：硕士

定位重组是由单个多肽酶（重组酶）识别特定的DNA序列（特异性识别位点）,并根据特异位点的相对方向对特异识别位点之间的DNA的进行交换、重组、删除与逆转的一种重组系统,整个反应过程可在体外进行且不需要额外能量和辅助因子的参与。... 详细信息

定位重组是由单个多肽酶（重组酶）识别特定的DNA序列（特异性识别位点）,并根据特异位点的相对方向对特异识别位点之间的DNA的进行交换、重组、删除与逆转的一种重组系统,整个反应过程可在体外进行且不需要额外能量和辅助因子的参与。本研究拟在该课题前期已建立的通过大规模PCR技术廉价、高效地获得大量线性DNA产物的方法的基础上,利用该系统建立一种新的体外获得环状DNA的方法,即将线性DNA通过定位重组系统转化为环状DNA,为实现高通量离体生产环状DNA提供理论依据。实验结果证实,利用前期已在酵母中表达的DNA聚合酶,我们成功地建立了50ml的PCR体系,通过该方法获得的PCR产物的浓度与常规的方法获得DNA浓度相当;同时将Cre重组酶在大肠杆菌表达系统中成功达,并初步证明纯化后的Cre重组酶具有在体外环化线性DNA的功能。这些结果为进一步实现更大规模的体外生产环状DNA方式奠定了坚实的基础。与传统的通过质粒抽提获得DNA的方法相比,利用大规模PCR和重组酶法获得的环状DNA具备无细菌内毒素和抗生素的污染、成本低、制备周期短等优点,且易删除与表达无关的DNA元件,因此该方法可为无细胞体系快速制备环状DNA开辟了一种新的途径。随后的研究中,我们拟通过大规模PCR的方法制备DNA疫苗,即利用大规模PCR技术获得大量编码某种抗原蛋白的外源基因的“盒式”表达结构产物,经简单纯化后作为线性DNA疫苗直接免疫机体。初步试验结果表明通过本方法获得的线性DNA疫苗具有一定的保护效果,但是与预期的目标还有一定的差距。鉴于环状DNA的稳定性优于线性DNA的,因此拟进一步将线性DNA经重组酶处理后形成环状DNA后作为疫苗免疫机体,检测能否获得更好的保护效果。总之,本研究为快速、大规模制备DNA疫苗迅速应对新发传染病提供了一种新的策略。

关键词：位点特异性重组大规模PCR 线性DNA 体外环化

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