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中药药理学体外实验方法研究进展

中国实验方剂学杂志 2024年

作者：张秋菊李能莲王宇金华甘肃中医药大学敦煌医学与转化教育部重点实验室

体外实验是中药药理学研究不可或缺的方法，但由于中药来源广泛、成分多样、理化性质不稳定等因素阻碍了其体外实验的开展。因此，寻找更为科学、合理的体外药理学研究方法已成为亟待解决的问题。目前中药药理学体外实验常用的方法有直... 详细信息

体外实验是中药药理学研究不可或缺的方法，但由于中药来源广泛、成分多样、理化性质不稳定等因素阻碍了其体外实验的开展。因此，寻找更为科学、合理的体外药理学研究方法已成为亟待解决的问题。目前中药药理学体外实验常用的方法有直接给药法和间接给药法，间接给药法又包括含药血清/浆法、含药肠吸收液法、含药肝孵育液法等。随着计算机技术和系统生物学的发展，将高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）、组学、网络药理学、计算机/人工智能辅助药物设计等技术与中药体外实验方法相结合，不仅大大降低了科研实验成本，还明显提高了中药药理作用探索、有效成分筛选及药物研发的效率，已逐渐被认可并广泛应用。本文就目前常用的中药药理学体外实验方法及其进展做一梳理，以期为选择合理的研究方法提供帮助。

关键词：中药药理学体外实验含药血清/浆含药肠吸收液含药肝孵育液法

基于网络药理学方法探析汉黄芩素治疗肝细胞癌作用机制和体外实验研究

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中国全科医学 2024年第32期27卷 4040-4049页

作者：杨安银刘红丽陈妙洋郑玉凤徐志远杨永峰南京中医药大学附属南京医院南京市第二医院肝病科江苏省南京市210000 东南大学医学院江苏省南京市210000 南京医科大学公共卫生学院江苏省南京市210000

背景肝细胞癌是癌症相关死亡的主要原因,目前的防治形势依然严峻,对新的肝细胞癌治疗药物进行探索研究具有科学意义。目的通过网络药理学方法分析汉黄芩素干预肝细胞癌的作用机制,并进行体外实验验证。方法在TCMSP数据库中检索汉黄芩素... 详细信息

背景肝细胞癌是癌症相关死亡的主要原因,目前的防治形势依然严峻,对新的肝细胞癌治疗药物进行探索研究具有科学意义。目的通过网络药理学方法分析汉黄芩素干预肝细胞癌的作用机制,并进行体外实验验证。方法在TCMSP数据库中检索汉黄芩素的药物靶点,从TTD、Gen Card、OMIM、Dis Gent数据库中收集肝细胞癌的疾病靶点。将收集的药物靶点和疾病靶点取交集,作为药物干预疾病的潜在靶点。对交集靶点运用R软件进行富集分析,使用STRING数据库和Cytoscape软件对交集靶点构建蛋白互作网络和筛选核心靶点。在GIEPA数据库对核心靶点行进一步分析。最后通过体外实验对前期分析结果进行验证:采用CCK-8试剂盒测定细胞活性;采用平板克隆形成实验测定细胞增殖;采用划痕实验测定细胞迁移;采用Western-blotting(WB)实验测定蛋白质表达水平。结果分析结果发现汉黄芩素的吸收、分布、代谢、排泄特性符合小分子药物成药规则并且毒性分析结果表明无毒性。收集到汉黄芩素靶点135个,肝细胞癌靶点8238个,两者交集靶点113个。通过对构建的蛋白互作网络筛选出的前10位的核心基因进行分析,发现细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)在肝细胞癌组织中m RNA水平较正常肝组织上调(P实验结果显示,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞克隆形成数均低于对照组(P实验结果表明,加入汉黄芩素37.5、75.0、150.0μmol/L组Hep G2细胞迁移率均低于对照组(P实验结果表明,加入汉黄芩素75.0、150.0μmol/L组PI3K、P-AKT/AKT、CDK1、SRC蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论汉黄芩素通过下调CDK1、SRC蛋白表达,减弱PI3K/AKT通路信号,抑制肝癌细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,从而达到干预肝细胞癌发生和进展的目的。

关键词：癌,肝细胞汉黄芩素网络药理学体外实验

基于生物信息学和体外实验探讨金钗石斛治疗2型糖尿病的药理机制

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中国医院药学杂志 2024年第14期44卷 1627-1634页

作者：曾美玲李朝阳胡乔耿克用左振宇周威贵州医科大学药学院贵州贵安新区561113 陕西中医药大学药学院陕西西安712046

目的:通过生物信息学、体外实验探讨金钗石斛对2型糖尿病的治疗作用。方法:通过生物信息学数据库筛选出金钗石斛提取物治疗2型糖尿病的潜在靶点,构建蛋白相互作用(PPI)网络。通过DAVID数据库进行基因本体GO富集分析和KEGG通路富集分析,... 详细信息

目的:通过生物信息学、体外实验探讨金钗石斛对2型糖尿病的治疗作用。方法:通过生物信息学数据库筛选出金钗石斛提取物治疗2型糖尿病的潜在靶点,构建蛋白相互作用(PPI)网络。通过DAVID数据库进行基因本体GO富集分析和KEGG通路富集分析,构建“药物-化合物-靶点-通路-疾病”网络。利用Autodock Vina 1.1.2对所筛选出的核心靶点与核心化合物进行分子对接。MTT法考察金钗石斛对链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠胰岛素瘤β(INS-1)细胞和小鼠胰岛素瘤β(NIT-1)细胞损伤的保护作用。Western blot方法考察金钗石斛提取物对NIT-1细胞的胰岛素信号通路核心靶点的影响,进行体外实验验证。结果:GO富集分析结果表明金钗石斛治疗2型糖尿病主要与胰岛素调节过程相关。KEGG通路富集分析结果表明金钗石斛通过PI3K-AKT信号通路、FOXO信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、脂质与动脉粥样硬化以及胰岛素信号通路来治疗2型糖尿病。筛选出5个核心靶点,包括AKT1、SRC、EGFR、MAPK1、PIK3CA;6个核心化合物gigantol、moniliformin、moscatilin、tristin、dihydroconiferyl、trans-N-coumaroyltyramine。核心靶点与核心化合物具有良好的结合活性,结合能均不超过-6.7 kcal·mol^(-1)。金钗石斛提取物能够改善STZ诱导INS-1细胞和NIT-1细胞损伤,保护胰岛β细胞,发挥治疗2型糖尿病的作用。金钗石斛提取物能够提高受损胰岛β细胞的p-PI3K、p-PI3K/PI3K、p-AKT、pAKT/AKT的蛋白表达水平(P<0.01)。结论:金钗石斛提取物通过胰岛素信号通路中PI3K-AKT途径保护胰岛β细胞功能、改善胰岛素合成分泌,从而治疗临床2型糖尿病。

关键词：金钗石斛 2型糖尿病生物信息学体外实验

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基于网络药理学方法、分子对接技术和体外实验探讨中药虎杖干预病毒性肺炎的分子机制

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山西中医药大学学报 2024年第4期25卷 421-430页

作者：王志晓史婉丽岳宝森赵峰张炜华西安市中医医院陕西西安710000

目的:通过网络药理学方法、分子对接技术和体外实验,探讨虎杖干预病毒性肺炎的可能作用机制。方法:通过TCMSP平台筛选中药虎杖的活性成分及其作用靶点,从GeneCards数据库筛选病毒性肺炎的相关靶点,取交集得到潜在作用靶点;通过STRING数... 详细信息

目的:通过网络药理学方法、分子对接技术和体外实验,探讨虎杖干预病毒性肺炎的可能作用机制。方法:通过TCMSP平台筛选中药虎杖的活性成分及其作用靶点,从GeneCards数据库筛选病毒性肺炎的相关靶点,取交集得到潜在作用靶点;通过STRING数据库结合Cytoscape 3.7.2软件对潜在作用靶点进行交集靶点蛋白互作(PPI)分析和拓扑学分析,得到虎杖核心成分和病毒性肺炎关键靶点。采用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析,结合Cytoscape 3.7.2软件构建“虎杖-活性成分-靶点-通路”调控网络。采用AutoDock Vina、OpenBabel、PyMOL等软件对虎杖活性成分和病毒性肺炎关键靶点进行分子对接。以脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549建立急性肺损伤模型,对网络药理学的研究结果进行验证。结果:共获得虎杖10个活性成分,对应188个作用靶点,病毒性肺炎靶点1216个,取药物与疾病交集靶点93个;槲皮素、木犀草素、毒扁豆次碱、β-谷甾醇等可能是虎杖的核心成分;丝氨酸/苏氨激酶1(Akt1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-6(IL6)、白介素-1β(IL1β)、JUN激酶(JUN)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、半脱氨酸蛋白酶-3(CASP3)等蛋白可能是虎杖干预病毒性肺炎的核心靶点;GO功能分析和KEGG通路富集分析发现,靶点蛋白在细胞外基质、线粒体、核浆、胞质等中通过调控细胞因子、生长因子、蛋白、蛋白激酶以及TNF、PI3K-Akt、Toll样受体等信号通路发挥作用。分子对接发现,虎杖5种核心成分与TNF、Akt1、CASP3、IL1β、JUN、TP53、VEGFA靶点均有强烈的结合能力,结合能体外实验结果表明,虎杖可以降低模型组TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),可以抑制Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:虎杖可能通过调控TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB等靶点干预病毒性肺炎,发挥治疗作用。

关键词：病毒性肺炎网络药理学分子对接虎杖体外实验

基于网络药理学、分子对接技术及体外实验验证探讨黄芩汤治疗肝癌的作用机制

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中医药导报 2024年第8期30卷 8-16页

作者：黄泽萍邓亚胜杨瑞宁志莹刘鑫张宸康贾微广西中医药大学广西南宁530200

目的:采用网络药理学、分子对接技术及体外实验研究黄芩汤治疗肝癌的潜在作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索黄芩汤中黄芩、芍药、大枣、甘草的活性成分及靶点,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.1... 详细信息

目的:采用网络药理学、分子对接技术及体外实验研究黄芩汤治疗肝癌的潜在作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索黄芩汤中黄芩、芍药、大枣、甘草的活性成分及靶点,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为条件进行筛选,使用Uniprot数据库进行靶点预测。以“liver cancer”为检索词,利用GeneCards、OMIM、DrugBank数据库获取疾病靶点,将药物的作用靶点与疾病的靶点通过韦恩图取交集,利用String数据库构建PPI蛋白互作网络图,将导出tsv数据文件导入Cytoscape 3.8.2软件,进一步筛选出核心靶点;将疾病、药物靶点导入Cytoscape软件,构建药物PPI与疾病PPI蛋白互作网络拓扑图,筛选出核心靶点。利用Cytoscape软件构建“药物-活性成分-靶点”网络图;利用DAVID数据库对共同靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。使用Python脚本和AutoDuck Vina 1.2.0软件对黄芩汤的核心成分与关键靶点进行分子对接,计算结合力值。体外实验通过CCK-8检测HepG2增殖,TUNEL染色检测凋亡,q-PCR检测核心靶点mRNA的水平,Western blotting实验对预测通路进行验证。结果:从黄芩汤中筛选出有效成分160个,对应的活性靶点为238个。疾病对应靶点筛选去重后为1 474个,利用韦恩图将药物有效成分与疾病靶点取交集,交集数目为120个;KEGG通路富集分析得到PI3K-AKT信号通路、癌症信号通路、乙型肝炎信号通路、AGE-RAGE信号通路、丙型肝炎信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等信号通路。生物过程(BP)主要包括对基因表达的正向调节、基因表达的负向调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、凋亡过程的负调控、凋亡过程的正向调控、细胞对肿瘤坏死因子的反应等。分子对接结果表明,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩素与TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA等关键靶点蛋白的分子对接结合力值均较稳定。细胞实验表明,黄芩汤含药血清能抑制HepG2细胞的增殖和抗凋亡能力,上调TP53 mRNA、CASP3 mRNA、PTEN mRNA表达,下调AKT1 mRNA表达,降低p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平。结论:黄芩汤治疗肝癌的作用机制主要是通过增强抑癌基因PTEN的表达活性,下调p-PI3K、p-AKT表达,从而抑制PI3K/AKT信号通路,诱导肝癌细胞凋亡来减弱HepG2细胞增殖能力。

关键词：肝癌黄芩汤含药血清网络药理学分子对接体外实验 HepG2细胞

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姜黄素抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究

生物医学工程学杂志 2022年第6期39卷 1158-1164页

作者：丁香岳冀蓉董碧蓉冷晓四川大学华西医院老年医学中心成都610041 约翰斯·霍普金斯医院老年科约翰斯·霍普金斯老年与免疫重建中心美国马里兰州21224

本文旨在探讨姜黄素(Cur)体外抗人巨细胞病毒(HCMV)的作用。通过体外培养人胚肺成纤维细胞,采用四唑盐(MTS)方法检测Cur对细胞活力的影响。本研究分为对照组、HCMV组、HCMV+膦甲酸钠(PFA)组和HCMV+Cur组,通过蚀斑实验观察各组细胞病变效... 详细信息

本文旨在探讨姜黄素(Cur)体外抗人巨细胞病毒(HCMV)的作用。通过体外培养人胚肺成纤维细胞,采用四唑盐(MTS)方法检测Cur对细胞活力的影响。本研究分为对照组、HCMV组、HCMV+膦甲酸钠(PFA)组和HCMV+Cur组,通过蚀斑实验观察各组细胞病变效应(CPE),采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测各组HCMV的DNA拷贝数,蛋白免疫印迹检测HCMV不同时序蛋白的表达情况。结果发现,在细胞毒性实验中,与对照孔相比,当Cur浓度小于等于15μmol/L时,Cur对细胞生长和活力没有明显影响(P>0.05)。HCMV感染细胞5 d后,细胞开始出现CPE,随着时间延长,蚀斑数量增加。Cur可以减少CPE的产生,且呈剂量依赖性。HCMV感染细胞后,其DNA拷贝数和蛋白表达量逐渐增多,呈时间依赖性;Cur能够显著抑制HCMV的DNA复制,并下调HCMV蛋白表达水平,呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P实验依据。

关键词：人巨细胞病毒姜黄素体外实验

基于网络药理学和体外实验探讨萆薢活性成分抗动脉粥样硬化的作用机制

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中国药学杂志 2023年第16期58卷 1484-1493页

作者：李国莺刘玉嫣周婉婉陈光亮安徽中医药大学中西医结合学院合肥230012 中药复方安徽省重点实验室合肥230012

目的运用网络药理学探讨萆薢活性成分抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的作用机制并通过体外实验加以验证。方法与结果利用中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis ... 详细信息

目的运用网络药理学探讨萆薢活性成分抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的作用机制并通过体外实验加以验证。方法与结果利用中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)筛选出萆薢中符合条件的2个活性成分,Swiss Target Prediction平台预测活性成分的潜在靶点46个,利用在线人类孟德尔遗传(online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库、人类基因综合数据库(GeneCards)和靶向治疗数据库(therapeutic target database,TTD)筛选出4698个AS的疾病靶点,Venny工具软件筛选出萆薢活性成分抗AS的交集靶标蛋白39个,Cytoscape 3.9.0筛选出核心靶点10个。借助Gene DENOVO在线网站进行基因本体富集分析得到1154个生物过程、37个细胞组分和149个分子功能相关信息,其中生物过程主要涉及脂质代谢和脂质生物合成等过程;京都基因与基因组百科全书通路富集分析得到103条信号通路,其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路位居首位。在体外,采用氧化低密度脂蛋白刺激THP-1源性巨噬细胞复制泡沫化模型,薯蓣皂苷元(diosgenin,DIO)各浓度组脂质蓄积程度较模型组明显减轻,泡沫细胞胆固醇含量降低,细胞脂质代谢关键酶p-AMPK活性和p-AMPK蛋白表达增加、羟甲戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR)活性及HMGCR蛋白表达明显降低。结论网络药理学预测和体外验证提示萆薢活性成分通过激活AMPK,抑制HMGCR以减少胆固醇合成,抑制巨噬细胞泡沫化,发挥抗AS的作用。

关键词：网络药理学体外实验薯蓣皂苷元动脉粥样硬化腺苷酸活化蛋白激酶脂质代谢

基于网络药理学及体外实验探讨黄芪甲苷治疗胃癌的机制

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中药新药与临床药理 2023年第9期34卷 1236-1244页

作者：陈凤琴樊涛宁月王蒙王宏伟李海龙甘肃中医药大学附属医院甘肃兰州730000 甘肃中医药大学第一临床医学院内科学教研室甘肃兰州730000 甘肃中医方药挖掘与创新转化重点实验室/甘肃省中药新产品创制工程实验室甘肃兰州730000

目的基于网络药理学方法及体外实验探讨黄芪甲苷治疗胃癌的分子机制。方法(1)通过SwissTarget、TargetNet、Super-PRED、pharmMapper数据库检索黄芪甲苷作用靶点;利用OMIM、GeneCards、TTD数据库筛选胃癌疾病相关靶点;取上述二者的交集... 详细信息

目的基于网络药理学方法及体外实验探讨黄芪甲苷治疗胃癌的分子机制。方法(1)通过SwissTarget、TargetNet、Super-PRED、pharmMapper数据库检索黄芪甲苷作用靶点;利用OMIM、GeneCards、TTD数据库筛选胃癌疾病相关靶点;取上述二者的交集靶点(共同靶点),即为黄芪甲苷治疗胃癌的潜在作用靶点。将交集靶点通过STRING平台建立蛋白互作(PPI)网络,并筛选出黄芪甲苷治疗胃癌的核心靶点。利用R语言包clusterProfiler软件进行潜在作用靶点的GO功能及KEGG通路富集分析,利用Cytoscape 3.8.2软件绘制“疾病-药物-通路-靶点”网络图。使用AutoDock 1.5.6软件进行核心靶点与黄芪甲苷的分子对接验证,并对关键靶点进行体外实验验证。(2)使用不同浓度(20、40、80、120、160、200μg·mL^(-1))黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞24、48、72、96 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况。采用80、120、160μg·mL^(-1)黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞48 h后,采用Western Blot法检测细胞PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS蛋白表达水平。结果(1)共得到87个黄芪甲苷治疗胃癌的潜在作用靶点;筛选出20个黄芪甲苷治疗胃癌的核心靶点;其中PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS等核心靶点与黄芪甲苷的结合能<-5.0 kcal·mol-1,有较好的结合活性;潜在作用靶点主要涉及蛋白激酶信号通路、氧化、化学应激等生物学过程,以及PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路等多条通路。(2)与对照组比较,黄芪甲苷在20~200μg·mL^(-1)浓度范围,分别干预24、48、72、96 h后,MKN-45、HGC-27细胞相对活力均明显降低(P<0.05,P<0.01),且呈现明显的时间、浓度依赖性。与对照组比较,120、160μg·mL^(-1)黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞48 h后,PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS蛋白表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),且呈现明显的浓度依赖性。结论黄芪甲苷通过PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS等多靶点,调控PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等多通路,发挥治疗胃癌的作用。

关键词：黄芪甲苷胃癌网络药理学分子对接 PI3K/AKT信号通路 MAPK信号通路体外实验

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紫草素抗金黄色葡萄球菌生物膜的体外实验

中国组织工程研究 2023年

作者：孙小波刘玉婷曾意荣江西省赣南医学院教务处广州中医药大学第一附属医院江西省赣州市中医院骨四科

背景：紫草素具有抗菌、抗病毒、抗氧化、促伤口愈合等作用。目的：观察紫草素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制效果。方法：采用肉汤微量稀释法分别检测紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度与最小杀菌浓度。将不同质量浓... 详细信息

背景：紫草素具有抗菌、抗病毒、抗氧化、促伤口愈合等作用。目的：观察紫草素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制效果。方法：采用肉汤微量稀释法分别检测紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度与最小杀菌浓度。将不同质量浓度的紫草素与庆大霉素组合应用，采用联合药敏实验观察抗金黄色葡萄球菌效果。检测不同质量浓度紫草素对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，采用结晶紫半定量黏附实验检测不同质量浓度紫草素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。采用扫描电镜与活菌计数法观察不同质量浓度紫草素对钛金属片表面金黄色葡萄球菌生物膜的影响。结果与结论：(1)紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为100,0.156μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度分别为400,0.156μg/mL，并且紫草素与庆大霉素联合应用具有相加的抗菌效果；(2)随着质量浓度的升高，紫草素抑制金黄色葡萄球菌生长的作用增强；不同质量浓度的紫草素均可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，当紫草素的质量浓度为2倍最低抑菌浓度时抑菌作用最强、最显著；(3)活菌计数实验显示，无论是钛金属块表面生物膜形成早期(黏附期)还是后期(成熟期)，紫草素对生物膜的形成均呈抑制作用，但在黏附期的抑制作用强于成熟期；扫描电镜观察结果显示，紫草素在生物膜黏附期(培养4-6 h)与生物膜成熟期(培养24 h)对生物膜形成均呈抑制作用，但在黏附期的抑制作用更强；(4)结果表明，紫草素对金黄色葡萄球菌生物膜有抗菌效果，对生物膜的抑制作用在生物膜形成早期(黏附期)最强、最明显。

关键词：紫草素金黄色葡萄球菌生物膜体外实验活菌计数法