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伊犁河谷区域银盾革蜱源马泰勒虫Te-Y株的分离、遗传进化分析及体外初始培养法的建立

伊犁河谷区域银盾革蜱源马泰勒虫Te-Y株的分离、遗传进化分析及体...

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作者：瓦热斯·吐尔松新疆农业大学

学位级别：硕士

马泰勒虫病是通过媒介蜱传播的一种马属动物血液原虫病,其病原为马泰勒虫(Theileia equi,旧称马巴贝斯虫Babesia equi),世界动物卫生组织(OIE)将该病列入B类动物疫病名录,属法定报告疫病,在我国被列为二类动物疫病。呈全球性流行,尚无疫... 详细信息

马泰勒虫病是通过媒介蜱传播的一种马属动物血液原虫病,其病原为马泰勒虫(Theileia equi,旧称马巴贝斯虫Babesia equi),世界动物卫生组织(OIE)将该病列入B类动物疫病名录,属法定报告疫病,在我国被列为二类动物疫病。呈全球性流行,尚无疫苗,诊断和治疗较滞后,发病和死亡率较高,严重制约着养马业的健康发展。银盾革蜱作为该病的传播及携带媒介在我区区系分布较广泛,导致该病频发、流行,严重影响着伊犁马业及当地牧民收入。本研究通过病原形态学、分子生物学,系统发育分类学等方法,以伊犁河谷区域为试验点,采集寄生于马体表的吸血革蜱鉴定归类及病例分析、分离血源性和蜱源性虫株、基于18S rRNA基因序列构建进化树,建立马泰勒虫体外初始培养法,为伊犁河谷区域马血液原虫病原及媒介蜱之间的关联研究和该病综合防控奠定基础。1.采集伊犁河谷区域3个县10个试验点的硬蜱(4780枚)和疑似马血样(546份),所采集的硬蜱经形态学和分子生物学进行种属鉴定,所采集的血样和蜱样经PCR和c ELISA方法检测马泰勒虫,筛选阳性。结果显示,银盾革蜱基节I外距比内距短,基节II,III外距细窄,呈锥状。气门板呈逗点形,背突较长而窄,向背方弯曲,底部边缘单排杯状体包围,顶部杯状体大量堆积。腹面内侧缘第1和2节刚毛排列紧密,第3节刚毛稀疏,根据这些局部特征鉴定为银盾革蜱;基于ITS2基因测序结果与Gen Bank中登录的伊朗银盾革蜱(GQ144706.1)同源性为99%,与形态鉴定结果一致,最终1050枚鉴定为银盾革蜱;PCR检测出银盾革蜱携带马泰勒虫的感染率为7.3%。在546份血样中,马泰勒虫PCR阳性率为19.7%(108/546),c ELISA阳性率为34.7%(190/546)。结果显示银盾革蜱为该区域的优势蜱种。2.基于18S rRNA基因序列设计特异性引物,经PCR方法扩增分离株Te-Y和蜱源性马泰勒虫DNA进行了测序与分析,并其他虫株序列对比(外蒙JQ657703.1、利雅得KJ801928.1、布达佩斯KM046922.1等),用Mega6.0软件绘制了马泰勒虫地方虫株进化树。结果显示,血源性和蜱源性马泰勒虫同源性为100%,与其它不同虫株之间的同源性为96%～100%,其中与韩国株(HM229407.1)、肇源株(KF559357.1)同源性最高,为100%;碱基组成中A,C,T和G碱基的平均含量分别为27.8%,18.5%,26.7%和26.8%,A+T的平均含量为54.5%,高于C+G的含量,表现出A+T偏倚性;Te-Y株在进化树上,与肇源株和韩国株聚为一支,置信度分别为95和93,亲缘关系最近,与其他不同地方虫株之间的遗传距离为0.000～0.076。3.采样两种气体相,第一种:37°C、2%O、93%N、5%CO和第二种:37°C,5%CO三气培养条件下,用完全培养基(包括M199培养基、马血清、双抗及次黄嘌呤),定时补充健康红细胞和更换培养基,建立了马泰勒虫体外初始培养法。结果显示,低感染率时供氧有助于虫体的生长(氧气浓度控制2%左右),马泰勒虫可以连续培养38 d,染虫率在3.0%到5.1%左右,最高感染率为5.4%,共继代6次。另外,血清终浓度确定为40%,未灭活血清支持马泰勒虫生长的能力比灭活血清高。终浓度0.2 m M次黄嘌呤控制红细胞溶解,从而提高虫体增长。经初始培养可为后续试验提供材料。

关键词：银盾革蜱马泰勒虫 18S rRNA基因体外培

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