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西南农业大学学报（自然科学版） 2001年第4期23卷 333-335页

作者：朱淑文吉泽绿李培昌上海交通大学农学院动物科学系上海201101 日本国宇都宫大学农学部畜产学科

长春花碱是一种常用的细胞分裂阻止剂 ,在细胞遗传学分析及体外受精胚的性别鉴定等方面有着重要意义。该研究对牛体外受精胚的第一卵裂期染色体标本制作及性比进行了分析。废弃牛卵巢内卵子经体外成熟培养 ,体外受精 2 0h后 ,在培养基... 详细信息

长春花碱是一种常用的细胞分裂阻止剂 ,在细胞遗传学分析及体外受精胚的性别鉴定等方面有着重要意义。该研究对牛体外受精胚的第一卵裂期染色体标本制作及性比进行了分析。废弃牛卵巢内卵子经体外成熟培养 ,体外受精 2 0h后 ,在培养基中添加 10 0ng/ml长春花碱处理 8h或 10h。结果表明 ,用长春花碱处理 8h的胚胎标本大部分含有可分析的中期分裂像并可进行性别判断 ,明显高于 10h处理的胚胎标本 (P 体外受精的胚胎的雄性发生率略高于雌性发生率。

关键词：牛卵子染色体长春花碱牛体外受精胚性别

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应用PCR方法对奶牛早期体外受精胚的性别鉴定

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甘肃畜牧兽医 2006年第2期36卷 10-12页

作者：卢春霞白杰刘长彬石国庆新疆石河子大学动物科技学院新疆石河子农垦科学院畜牧兽医研究所

试验以牛雄性特异序列BOV97M和牛属1.715卫星DNA序列设计引物进行PCR扩增,以进行牛的性别鉴定。共检测76枚胚胎,37枚为雌性,39枚为雄性,把雌性胚胎进行移植,受胎11头,受胎率29.73%,产出母犊10头,准确率为90.91%。

关键词：奶牛性别鉴定 PCR 体外受精胚

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牛克隆胚发育相关基因启动子区DNA甲基化模式比较研究

牛克隆胚发育相关基因启动子区DNA甲基化模式比较研究

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作者：申艳丽华中农业大学

学位级别：硕士

胚胎发育是精卵结合表观重编程的过程,DNA甲基化是表观重编程修饰的一种主要形式,参与细胞的多种生理活动。DNA甲基化可使参与胚胎发育的基因有序表达,维持胚胎的正常发育。牛是单胎动物,为提高牛的繁殖力,更多地采用体外培养的方式获... 详细信息

胚胎发育是精卵结合表观重编程的过程,DNA甲基化是表观重编程修饰的一种主要形式,参与细胞的多种生理活动。DNA甲基化可使参与胚胎发育的基因有序表达,维持胚胎的正常发育。牛是单胎动物,为提高牛的繁殖力,更多地采用体外培养的方式获得牛早期胚胎,然后进行移植。但由于各种原因,体外胚易发生早期死亡,其成活率远低于体内胚,对畜牧业生产造成一定的损失。目前已证实异常的DNA甲基化导致胚胎发育失败,因此本文从早期胚胎死亡角度出发,采用亚硫酸氢盐测序法,研究与牛早期胚胎发育相关基因OCT4、Nanog启动子区的甲基化,以揭示与胚胎发育相关基因的甲基化模式,推测克隆胚发育失败的原因,进而预测早期胚胎死亡的可能信号,提高体外胚的成活率,指导实验室生产。研究结果如下： 1.本试验以牛的孤雌胚胎为材料,探讨获得高浓度胚胎基因组DNA的方法。结果表明：首先使用蛋白酶K除去透明带,然后用本试验方法可以获得浓度相对高的基因组DNA。 2.检测了OCT4基因在不同时期死亡胚胎的甲基化模式。结果表明OCT4基因在2-细胞、4-细胞、8-16细胞和桑葚胚阶段死亡的克隆胚的甲基化水平分别为90.50%、90.00%、92.30%、77.70%,在体外受精胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为87.80%、81.10%、88.50%、70.60%。表明OCT4基因启动子在早期死亡胚的甲基化水平较高,且在克隆胚的甲基化水平高于体外受精胚的甲基化水平,但克隆胚和体外受精胚各阶段甲基化差异不显著(P>0.05);同时克隆胚和体外受精胚OCT4的甲基化水平从8-16细胞到桑葚胚呈下降趋势。 3.检测了Nanog基因在不同时期死亡胚胎的甲基化模式。研究表明Nanog在克隆胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞和桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为46.15%、42.31%、48.46%、53.85%,在体外受精胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为63.85%、56.92%、69.23%、53.07%。表明Nanog基因启动子在早期死亡的体外受精胚的甲基化水平较克隆胚的高;在早期死亡的克隆胚中,Nanog甲基化水平从8-16细胞到桑葚胚时上升,而在体外受精胚则下降。同时Nanog启动子在体外受精胚的甲基化水平高于克隆胚。 4.总的来说,早期死亡胚中,OCT4基因启动子的甲基化高于Nanog的,推测可能由于OCT4异常的甲基化使Nanog发生异常甲基化,二者异常的甲基化可能导致早期胚胎的死亡 5.对甲基化水平存在差异的阶段进行定量分析。结果表明：不论何种方式获得的早期死亡的胚胎,其OCT4的表达量高于Nanog,且只在桑葚胚时期检测到少量Nanog的表达。推测可能由于OCT4的过度表达限制了Nanog的表达。 6.结合以上推测2-细胞阶段可能是早期胚胎死亡的信号,因此可考虑体外培养时加入一定浓度的抑制剂以提高体外成活率。

关键词：孤雌胚体外受精胚克隆胚 OCT4 Nanog 定量分析

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猪体细胞克隆胚胎着床前发育期间H3K27乙酰化重编程规律研究

猪体细胞克隆胚胎着床前发育期间H3K27乙酰化重编程规律研究

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作者：周娜汝安徽农业大学

学位级别：硕士

体细胞克隆技术为创制抗病、产品品质提升、节粮和环保等目标性状改良的转基因猪育种新材料提供了可能，也有助于拓展以猪为模型，开展人类相关疾病研究，尤其是与转基因、干细胞等生物技术结合，有望建立猪源生物反应器以生产药物蛋白... 详细信息

体细胞克隆技术为创制抗病、产品品质提升、节粮和环保等目标性状改良的转基因猪育种新材料提供了可能，也有助于拓展以猪为模型，开展人类相关疾病研究，尤其是与转基因、干细胞等生物技术结合，有望建立猪源生物反应器以生产药物蛋白、为人类器官移植开辟异源供体以及生物学机理研究等提供革命性的手段。目前克隆效率依然低下，其最根本原因是表观重编程不彻底。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化/去甲基化、组蛋白修饰（如乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、SUMO化、磷酸化等）等。其中组蛋白是染色体上核小体的核心，其物理学和化学修饰的变化都会影响相应区域的基因表达，从而参与调控真核细胞的生长和发育，但目前对组蛋白修饰，尤其是乙酰化修饰是否参与猪胚胎着床前期发育的研究极少。故本研究拟以H3K27ac为对象，检测H3K27ac在体外受精胚（In vitro fertilization embyo，IVFE）、体细胞克隆胚（Nuclear transfer embryo，NTE）以及孤雌激活胚（Parthenogenetic activationembryo，PAE）等不同类型猪着床前胚胎不同发育阶段的表达量，进而揭示同一类型胚胎整个着床前发育阶段的动态变化规律，通过比较不同类型胚胎的变化趋势，关联胚胎发育命运，为揭示H3K27ac在猪NTE早期发育期间的作用机制奠定基础。试验一：旨在揭示猪胚胎着床前发育期间H3K27ac的动态变化谱。首先，对H3K27ac抗体特异性进行了检测。用竞争性免疫多肽在猪孤雌囊胚上做验证，结果显示没有H3K27ac信号，表明本文所用抗体H3K27ac是特异性的。我们检测了H3K27ac在NTE和PAE激活后第15min、30min和1h的表达，根据NTE的H3K27ac水平，追踪这一修饰的源头;进而以IVFE为参照，重点分析了猪NTE在2hpa、6hpa、12hpa、14hpa、16hpa、1cell、2cell、4cell、8cell、morula、EB、EXPB和HB时期的H3K27ac表达水平。结果如下：MII期卵母细胞H3K27ac呈低水平，并一直持续到卵母细胞孤雌激活后30min，直到1h后H3K27ac水平才有升高的趋势。核移植供体细胞H3K27ac水平很高，同第15min、30min、1h的NTE的H3K27ac水平相当。在NTE2hpa、6hpa、12hpa、14hpa H3K27ac表达水平很高，16hpa开始减弱，4cell、8cell降至最低，morula时H3K27ac荧光信号有增强趋势，直到blastocyst增至最强，这与PAE和IVFE的H3K27ac表达模式相同，不同的是，NTE HB的H3K27ac水平减弱，同PAE HB，而IVFE HB依然维持稳定高水平H3K27ac。结果表明，NTE的H3K27ac这一修饰来源于供体细胞，并且4cell、8cell阶段H3K27ac的去除可能更有利于胚胎基因组激活。试验二：目的是探讨猪胚胎基因组激活前H3K27ac表达逐渐降低是否依赖于DNA复制、RNA转录和蛋白质合成。首先，将孤雌激活后6h的卵母细胞分别经3μ***-1阿非迪霉素处理12h、25μ***-1鹅膏覃碱处理24h、50μ***-1放线菌酮处理24h后，再解除抑制，各自在新鲜PZM-3继续培养24h、12h、12h，设置对照。结果发现：三个处理组同对照组相比，H3K27ac水平相当且很低，而孤雌激活后6h的卵母细胞H3K27ac水平很高。表明，H3K27ac去除是一个主动的过程。试验三：为探索H3K27ac乙酰化酶与去乙酰化酶的动态变化规律，我们收集了GV期和MII期卵母细胞各20枚，IVFE、NTE和PAE的1cell、2cell、4cell和blastocyst胚胎各20枚。定量结果显示：IVFE在1cell、2cell、4cell和blastocyst的HACD1、HACD2、CBP和MBD3要比NTE和PAE同时期胚胎相应基因表达量高。其中，NTE中HACD2表达较高，且在4cell时期NTE的HACD2高于1cell、2cell和blastocyst的NTE的相应基因的表达量。结果表明，这种时空表达差异可以为更多的转录翻译合成组蛋白去乙酰化酶，使4cell、8cell时期H3K27ac能够有效去除，似乎更利于胚胎基因组激活。试验四：旨在研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对猪克隆胚胎早期发育的作用及分子机制。将重构胚经50nM TSA处理24h后，去除TSA，PZM-3继续培养，设置对照，2d、7d后分别观察并记录胚胎卵裂与囊胚发育情况并收集囊胚，免疫荧光。结果：TSA处理组明显提高了囊胚率（42.5%±2.8%vs.16.0%±3.7%）和总细胞数（77

关键词：体外受精胚体细胞克隆胚孤雌激活胚 H3K27ac 免疫荧光

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