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λ噬菌体包装蛋白的制备与λ-DNA的体外包装(简报)

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中国医学科学院学报 1984年第6期 393-393页

作者：杨善蓉刘敬忠吴冠芸荣洋中国医学科学院基础所首都医大学生

构建基因文库是研究真核基因结构与功能以及人类遗传性疾病分子基础的必经之路。而提取高质量的λ噬菌体包装蛋白以便得到高效率的λ-DNA体外包装,则是构建基因文库成

关键词：体外包装 DNA 基因文库蛋白

二乙基亚硝胺(DEN)诱发λ/lacZ转基因小鼠微核和基因突变实验研究

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卫生研究 2005年第3期34卷 269-271页

作者：詹立张立实王莉朱玲张浩铃木孝昌本间正充吴德生四川大学华西医院国家(成都)中药安全性评价中心成都610041 四川大学华西公共卫生学院日本国立医药品食品卫生研究所遗传变异部

目的　应用λlacZ转基因小鼠检测二乙基亚硝胺(DEN)诱发体内遗传毒性。方法　小鼠腹腔注射DEN(2. 5mg kg) ,每周1次,连续4周。染毒4 8小时后检测外周血微核细胞率。末次染毒7天后处死动物,提取组织DNA ,通过体外包装反应获得并测定肝脏... 详细信息

目的　应用λlacZ转基因小鼠检测二乙基亚硝胺(DEN)诱发体内遗传毒性。方法　小鼠腹腔注射DEN(2. 5mg kg) ,每周1次,连续4周。染毒4 8小时后检测外周血微核细胞率。末次染毒7天后处死动物,提取组织DNA ,通过体外包装反应获得并测定肝脏、肺脏、膀胱lacZ基因突变频率。结果　DEN诱发微核率与对照组无显著性差异,肝脏组织lacZ基因突变(MF)为2 6 8 .4×10 - 6 ,是对照组的6 .13倍,肺脏MF也明显高于对照,是其3 6 6倍,而膀胱组织MF则与对照无显著性差异。结论　肝脏、肺脏均是DEN致突变的靶器官,但对其敏感度并不相同。

关键词：二乙基亚硝胺转基因小鼠实验研究诱发显著性差异 lacZ 基因突变频率微核细胞率遗传毒性腹腔注射体外包装肝脏组织膀胱组织对照组 DEN 外周血 DNA 肺脏微核率靶器官致突变敏感度检测染毒 MF

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家蝇基因组文库的构建

中国兽医学报 2003年第5期23卷 421-423页

作者：夏平安刘维全江禹李晓艳殷震解放军军需大学军事兽医研究所

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。... 详细信息

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。重组噬菌体转染 KW2 51 宿主菌 ,测定文库效价为 5× 10 4 pfu/m

关键词：家蝇基因组文库重组噬菌体基因转化体外包装昆虫抗菌肽生物反应器抗生素

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基于CRISPR/Cas9的天然产物生物合成基因簇靶向克隆技术的建立及应用

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基于CRISPR/Cas9的天然产物生物合成基因簇靶向克隆技术的建立及...

作者：陈丽武汉大学

学位级别：硕士

随着测序技术和生物信息学的飞速发展,越来越多的微生物基因组信息被揭示,通过对这些基因组信息的分析发现,目前已发现的天然产物仅仅只是微生物天然产物宝库的冰山一角,微生物基因组中还蕴藏着巨大的潜能等待挖掘。为了更加高效的挖掘... 详细信息

随着测序技术和生物信息学的飞速发展,越来越多的微生物基因组信息被揭示,通过对这些基因组信息的分析发现,目前已发现的天然产物仅仅只是微生物天然产物宝库的冰山一角,微生物基因组中还蕴藏着巨大的潜能等待挖掘。为了更加高效的挖掘微生物天然产物,特别是对于那些难以建立遗传操作系统或者是实验室无法培养的微生物而言,在基因组时代的今天,异源表达天然产物基因簇已成为一种有效的天然产物挖掘策略。因此,开发更加多样化、操作快速、简便的天然产物基因簇克隆技术显得尤为重要。本研究旨在建立一种基于CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein)基因编辑系统和体外包装系统相结合的一步法克隆技术,并应用该技术进行天然产物基因簇的靶向克隆,为微生物天然产物研究提供有效的技术支持。本策略利用Cas9蛋白将靶标片段从基因组DNA精确切割,然后经体外包装蛋白的包装侵染最终获得靶标基因簇。为了验证该靶向克隆策略,本研究以源于Streptomyces thiolactonus NRRL 15439的Tu?3010生物合成基因簇(27.4 kb)和源于Micromonospora inyoensis DSM 46123的西索米星(Sisomicin)生物合成基因簇(40.7 kb)为例,用来检测克隆片段大小接近噬菌体体外包装系统极限时的克隆效率。基于体外包装介导的一步法靶向克隆技术,我们分别从随机挑选的菌落中通过一轮PCR扩增,快捷、高效的克隆到了Tu?3010生物合成基因簇和西索米星生物合成基因簇,克隆效率分别为18%和54%。这两个案例表明,基于CRISPR/Cas9系统的体外包装克隆策略的有效克隆范围虽然与噬菌体体外包装容量(30-45 kb)一致,但是该克隆策略具有精准、耗时短且操作方便等特点,对于中等大小微生物天然产物基因簇的克隆具有重要的应用价值。我们将基于CRISPR/Cas9系统的体外包装克隆策略与本实验室前期开发的In vitro CRISPR/Cas9 editing(ICE)基因编辑技术偶联使用,在体外对Tu?3010基因簇中的调控基因stu R进行了同框缺失和启动子重构编辑。此外,运用该技术对*** DSM 46123基因组中的另一个未知化合物生物合成基因簇thp进行了启动子重构编辑。异源表达结果表明,stu R对Tu?3010的合成具有正调控作用,但对其进行启动子重构却未对Tu?3010的合成造成明显影响;thp基因簇的启动子重构未能成功激活基因簇的表达。本研究还尝试将体外包装介导的靶向克隆策略与Gibson Assembly技术或是TAR(Transformation associated recombination)克隆技术偶联使用,克隆来自*** DSM 46123的一个具有良好生物活性的化合物生物合成基因簇tln(64.3 kb),此部分工作目前仍在进行中。

关键词：天然产物生物合成基因簇 CRISPR/Cas9 体外包装基因编辑异源表达

酵母脯氨酸合成酶基因（Pro2）的分离及Leu+ Pro+表型共转导

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Journal of Genetics and Genomics 1986年第3期 163-171页

作者：宣建武,匡达人中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院上海细胞生物学研究所安徽合肥中国科技大学生物系

酵母7209-1 A（a）DNA,用pHC79为载体,以BamHⅠ、PstⅠ和Hind Ⅲ酶切,经体外重组和包装后,转导至大肠杆菌HB101和SC294中。在我们的实验条件下（对酵母DNA适度酶解,F/V值为15,连接时DNA总浓度为200—250微克/微升以及BHB 2688/BHB2690... 详细信息

酵母7209-1 A（a）DNA,用pHC79为载体,以BamHⅠ、PstⅠ和Hind Ⅲ酶切,经体外重组和包装后,转导至大肠杆菌HB101和SC294中。在我们的实验条件下（对酵母DNA适度酶解,F/V值为15,连接时DNA总浓度为200—250微克/微升以及BHB 2688/BHB2690比值为5）,重组建库效率达到10～6CFU/微克载体DNA,重组子双抗值降低到10％或5％以下。大肠杆菌HB101和SC 294的10～6个重组体克隆中,观察到酵母基因对leuB 6及proA2（在HB101中）,leu6,metB1,argG,his1（在SC294中）等营养缺陷型的互补（校正）效应。由于互补频率(10-3—10-4)比上述基因突变自发回复率高2—3个数量级,因此可以说,酵母的上述基因在大肠杆菌中获得了功能表达。对pYeleu5和pYeleu7单克隆DNA的再次包装转导和再次互补测试表明,我们已使酵母leu+的互补效率提高10～4倍。本文还报道了在HB101中的酵母基因文库Leu+Pro+的表型共转导现象,频率为30％以上。

关键词：酵母 HB Leu Pro2 共转导体外包装酵母基因 DNA 表型

转基因动物突变研究模型及其在遗传毒理学中的应用

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癌变·畸变·突变 1996年第4期8卷 55-66页

作者：黎怀星傅继梁第二军医大学基础部生物学教研室

转基因动物突变研究模型及其在遗传毒理学中的应用黎怀星傅继梁第二军医大学基础部生物学教研室上海２００４３３１前言基因突变与肿瘤发生、发育畸形、遗传性疾病、衰老以及进化等医学和生命科学问题均有密切的关系，因此对人和哺乳动... 详细信息

转基因动物突变研究模型及其在遗传毒理学中的应用黎怀星傅继梁第二军医大学基础部生物学教研室上海２００４３３１前言基因突变与肿瘤发生、发育畸形、遗传性疾病、衰老以及进化等医学和生命科学问题均有密切的关系，因此对人和哺乳动物体内基因突变机理的研究是生命科学...

关键词：基因突变序列分析点突变 λ噬菌体噬菌斑突变子体外包装转基因动物生物技术产品遗传毒理学

应用λgt11系统克隆和表达细小病毒的非结构蛋白基因

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甘肃农大学报 1987年第1期 1-11页

作者：沈正达甘肃农业大学兽医系家畜传染病学教研组

大肠杆菌噬菌体λgt11是在原有基础上经不断改进而组建成的一个新的基因载体,通过一系列检测方法的建立,已成为一个完整的基因操作系统。本文应用此系统对细小病毒的非结构蛋白基因NSI进行了克隆和表达试验,包括目的基因的制备、载体DN... 详细信息

大肠杆菌噬菌体λgt11是在原有基础上经不断改进而组建成的一个新的基因载体,通过一系列检测方法的建立,已成为一个完整的基因操作系统。本文应用此系统对细小病毒的非结构蛋白基因NSI进行了克隆和表达试验,包括目的基因的制备、载体DNA的提取、基因拼接、噬菌体的体外包装、重组噬菌体蚀斑和溶原菌的抗体探子筛选以及重组体基因产物的检测,最后获得了由重组体基因表达产生的融合蛋白质。此蛋白质能被兔源抗NSI抗体和自然感染细小病毒的犬血清特()性地结合。试验结果表明,λgt11是基因操作的一个有效的载体系统,它在疫病的血清学诊断和疫病预防的研究上具有广阔的应用前景。

关键词：蚀斑溶原菌噬菌体体外包装 DNA 细小病毒细小脱氧核糖核酸病毒非结构蛋白基因 gt11

黑斑蛙(Rana nigromaculata)和小鼠(Mus musculus)基因文库的构建

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中国科学(B辑化学生物学农学医学地学) 1982年第2期 139-145页

作者：陈受宜劳为德倪祖梅施履吉中国科学院生物物理研究所中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院上海细胞生物学研究所北京

本文采用了Collins所建立的Cosmid方法,用内切酶Bam HI和Pst I,建立了黑斑蛙和小鼠的Bam HI及Pst I的基因文库,这些基因文库所需的菌落数或重组的杂种DNA片段数是根据作者用近似法求得的公式计算的,这公式适用于高等动植物。文中还利用C... 详细信息

本文采用了Collins所建立的Cosmid方法,用内切酶Bam HI和Pst I,建立了黑斑蛙和小鼠的Bam HI及Pst I的基因文库,这些基因文库所需的菌落数或重组的杂种DNA片段数是根据作者用近似法求得的公式计算的,这公式适用于高等动植物。文中还利用Cosmid受体细胞的营养缺陷性质,分离出互补于这些缺陷的基因。

关键词：基因文库限制性内切酶 DNA Rana nigromaculata Mus musculus 黑斑蛙体外包装中包装小鼠小家鼠

家蚕(Bombyx mori)基因文库的建立和鉴定

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中国科学技术大学学报 1986年第1期 99-104页

作者：宣建武中国科学技术大学生物系

组建家蚕Bombyx mori品种754和东肥的基因文库.用cosmid 质粒pHC 79在BamH1和Pst1位点进行休外重组和包装,转导至*** 受体菌HB101中,获得10~7以上的重组体克隆,统计分析表明库内已包括了将近100%的家蚕基因组的遗传信息.试验分析了包装... 详细信息

组建家蚕Bombyx mori品种754和东肥的基因文库.用cosmid 质粒pHC 79在BamH1和Pst1位点进行休外重组和包装,转导至*** 受体菌HB101中,获得10~7以上的重组体克隆,统计分析表明库内已包括了将近100%的家蚕基因组的遗传信息.试验分析了包装混合物BHB2688/BHB2690体外连接的家蚕/载体DNA 的比值以及家蚕总DNA 酶解程度对重组建库的影响,使建库效率达到10~6—10~7CFU/μg 载体DNA,双抗值低至5%以下.在对基因文库进行鉴定时发现了克隆的家蚕DNA 片段对HB101的leu pro 基因突变的互补(校正)效应,频率为10-5.

关键词：体外包装效价滴度 Bombyx mori 基因文库 DNA 桑蚕家蚕基因载体质粒