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脊尾白虾精子体外保存的研究

海洋科学 2013年第3期37卷 95-101页

作者：浦蕴惠许星鸿高焕刘兆普阎斌伦南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室江苏南京210095 淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室江苏连云港222005

采用精子存活率和顶体酶活力两种评价精子质量方法,研究了不同稀释剂与抗冻保护剂对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)精子体外保存效果的影响。结果表明:稀释剂Ⅰ-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4 d后,稀释剂Ⅰ... 详细信息

采用精子存活率和顶体酶活力两种评价精子质量方法,研究了不同稀释剂与抗冻保护剂对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)精子体外保存效果的影响。结果表明:稀释剂Ⅰ-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.803μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著γ=0.846(P保存2 d后,稀释剂Ⅰ组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.507μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂Ⅰ组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(P保存的最佳抗冻保护剂,此条件下超低温保存2 d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.385μIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数γ=0.864(P<0.01)。

关键词：脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) 精子体外保存稀释剂抗冻剂

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胎儿脑组织体外保存获取神经干细胞的时限

解剖学报 2002年第5期33卷 449-452页

作者：姜传涛杨秋慧苏玉金赵春礼杨慧徐群渊首都医科大学北京神经科学研究所北京100054

目的　探讨人胎儿脑海马组织体外保存不同时限后培养获取神经干细胞的可行性。　方法　利用无血清培养 ,从死亡后孵育在 4℃Hank液 0h、4h、2 4h、4 8h、72h及 96h的胎儿海马分离细胞 ,在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学方法检... 详细信息

目的　探讨人胎儿脑海马组织体外保存不同时限后培养获取神经干细胞的可行性。　方法　利用无血清培养 ,从死亡后孵育在 4℃Hank液 0h、4h、2 4h、4 8h、72h及 96h的胎儿海马分离细胞 ,在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学方法检测培养细胞的神经上皮干细胞蛋白 (nestin)表达、经BrdU孵育后的BrdU表达以及诱导分化后的神经元标记 (tubulin)或星型胶质细胞抗原 (GFAP)表达 ;比较不同时限的细胞在Nestin的表达、增殖能力和诱导分化后神经元及胶质细胞比例的差异。　结果　从保存在 4℃Hank液 72h以内的各组胎儿海马中均可获得具有连续增殖能力的神经球 ,培养出的细胞Nestin表达为阳性 ,通过BrdU的摄取表明细胞处于活跃的有丝分裂状态 ,在此期限内各组之间无明显差异 ;诱导分化后的神经元和胶质细胞比例在各组之间亦相似 ;但随着在Hank液中孵育时间的延长 ,所获得的神经球数量呈减少趋势 ;在 96h组则未能获得神经球。　结论　人胎儿海马组织在 4℃Hank液中孵育 72h内可培养出呈神经球样生长的神经干细胞。

关键词：胎儿脑组织体外保存神经干细胞时限无血清培养

猪卵巢体外保存温度对卵母细胞染色质构型和成熟能力的影响

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动物学报 2005年第5期51卷 919-923页

作者：岳奎忠陈新孙兴参李子义朱赫卞志明谭景和东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 解放军空军总医院北京100000 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

Most porcine oocytes used in studies on embryo biotechnology and the in vitro production of embryos are currently obtained from the ovaries of slaughtered gilts. The duration and temperature during ovary transportation and handling might, therefore, affect the recovery of culturable COCs, chromatin configuration and developmental competence of oocytes. The effects of ovary storage temperature on chromatin configuration and in vitro maturation of porcine oocytes were examined in this study. Ovaries collected from a slaughterhouse were stored in vitro for 8 h under different temperatures. The results showed that more culturable COCs were isolated from the ovares stored at 39℃ than that from ovaries stored at 31℃ or 20℃ and before storage. Thirty-one centidegree was the best storage temperature in terms of cumulus expansion, nuclear maturation and morphology of the first polar body after in vitro maturation culture. The ability of cumulus expansion was completely lost in COCs derived from ovaries stored at 39℃for 8 hours. Ovary storage (at both 31℃ and at 20℃) increased the proportion of oocytes with the GVc configuration in which chromatin condensed into a single big clump at the nucleolus and the functional significance of this configuration needs further investigations.

关键词：猪卵巢体外保存保存温度卵母细胞染色质构型成熟能力

光学法检测血小板体外保存期间跨膜电位的变化

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中国输血杂志 2016年第10期29卷 1120-1123页

作者：乔郑磊陆萍李睿书凌冰朱自严华东师范大学生命科学学院上海200241 上海市血液中心

目的建立使用流式细胞仪检测血小板跨膜电位的方法,观察血小板在体外保存期间跨膜电位变化。方法使用电压敏感染料Di BAC4(3)对20(人)份血小板(20 m L/份)染色后,用流式细胞仪测定血小板在静息状态下和完全去极化时的荧光强度,根据能斯... 详细信息

目的建立使用流式细胞仪检测血小板跨膜电位的方法,观察血小板在体外保存期间跨膜电位变化。方法使用电压敏感染料Di BAC4(3)对20(人)份血小板(20 m L/份)染色后,用流式细胞仪测定血小板在静息状态下和完全去极化时的荧光强度,根据能斯特方程计算血小板跨膜电位,并利用此方法观察血小板在体外保存期间跨膜电位的变化情况。结果 20人份新鲜血小板跨膜电位平均值为(-56±4)m V,CV=5.5%,与膜电位钳法得到的结果(-50-60)m V相似,保存1、3、5 d的血小板跨膜电位分别为(-56±4)、(-54±8)和(-46±6)m V,其中血小板跨膜电位在血小板保存1 d时明显高于5 d(P<0.05)。结论所建立起的方法用于测定血小板跨膜电位准确、可靠。

关键词：血小板体外保存跨膜电位电压敏感染料荧光强度流式细胞仪

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外周血造血干细胞体外保存的研究进展

实用医学杂志 2009年第22期25卷 3908-3910页

作者：娄琳陆志刚南方医科大学珠江医院输血科广州市510282

外周血造血干细胞移植（PBSCT）是目前治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。外周血造血干细胞的体外保存是PBSCT的重要组成部分。如何经济、高效地体外保存外周血造血干细胞,一直受到国内外的关注。现就有关外周血造血干细胞的体外... 详细信息

外周血造血干细胞移植（PBSCT）是目前治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。外周血造血干细胞的体外保存是PBSCT的重要组成部分。如何经济、高效地体外保存外周血造血干细胞,一直受到国内外的关注。现就有关外周血造血干细胞的体外保存技术的研究进展作一综述。

关键词：外周血造血干细胞移植体外保存恶性血液病 PBSCT 保存技术实体瘤前治疗国内外

L-肉毒碱对牛精液体外保存时间及品质的影响

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家畜生态学报 2017年第12期38卷 43-47页

作者：李晓霞曹平华韩文霞禹学礼河南科技大学动物科技学院河南洛阳471023

精液体外孵育保存会使精子品质下降,抗氧化剂L-肉毒碱可促进激活的脂肪酸从细胞质到线粒体基质的转运,减少ROS产生和脂质过氧化反应的发生。研究分析了牛精液体外保存过程中不同浓度L-肉毒碱(LC)(0、2、10和15mmol/L)和不同孵育时间(2、... 详细信息

精液体外孵育保存会使精子品质下降,抗氧化剂L-肉毒碱可促进激活的脂肪酸从细胞质到线粒体基质的转运,减少ROS产生和脂质过氧化反应的发生。研究分析了牛精液体外保存过程中不同浓度L-肉毒碱(LC)(0、2、10和15mmol/L)和不同孵育时间(2、4、6h)对牛精子活力、质膜完整性、线粒体活性和顶体完整性的影响。结果表明:与对照组相比,在牛精液体外保存稀释液中添加10mmol/L和15mmol/L的LC均可显著(P体外孵育2、4、6h后,其精子的活力、质膜完整率和线粒体高膜电位百分率均显著高于对照组(P0.05)。由此可见,LC可保护精子功能和结构免受损伤,不仅能改善牛精液体外保存的品质参数,又可延长牛精液体外保存的时间。

关键词： L-肉毒碱牛精液品质体外保存

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骨软骨组织体外培养保存方法的探索

骨软骨组织体外培养保存方法的探索

作者：胡遵杰泰山医学院

学位级别：硕士

目的通过对4℃和37℃温度条件以及保存过程中是否更换培养液对软骨细胞活性影响的比较选出适合液体培养保存骨软骨组织的温度和液体处理条件。再观察加入了EGCG与IGF-Ⅰ的培养液对细胞活性的影响，以探索培养液的有效成份，为进一步寻... 详细信息

目的通过对4℃和37℃温度条件以及保存过程中是否更换培养液对软骨细胞活性影响的比较选出适合液体培养保存骨软骨组织的温度和液体处理条件。再观察加入了EGCG与IGF-Ⅰ的培养液对细胞活性的影响，以探索培养液的有效成份，为进一步寻找最佳的培养液提供指导。材料与方法本实验分两部分。第一部分:不同保存温度及换液与否的比较。以羊踝关节软骨为实验材料，将获取的同样大小的踝关节骨软骨块120枚经过无菌PBS液冲洗后随机分配到4组相同的无菌培养瓶中，分别向这四组瓶中加入相同的基础培养液，成份为89%EMEM培养液、10%胎牛血清（FBS）和1%的青链霉素（各100UI/ml），标准为没过组织块0.5cm。根据保存方式的不同将其分为A、B、C、D四个组，其中A组保存于4℃冰箱中，每隔两天换液一次;B组保存于4℃冰箱中，保存全程不换液;C组保存于37℃，5%CO2培养箱中，每隔两天换液一次;D组保存于37℃，5%CO2培养箱中，保存全程不换液。分别于保存第7、21、35天每组取出10块进行检测，检测项目包括EB/FDA双荧光法测细胞存活率、HE、番红-O染色，观察并比较各组之间在不同时间点细胞存活率和活性的区别。第二部分: EGCG、IGF-Ⅰ及其共同作用对液体保存骨软骨组织的影响。同样以羊踝关节软骨为实验材料，取180枚骨软骨块经过与上一步同样的处理后随机分配到4组相同的无菌培养瓶中，并根据培养液成份的不同将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个组，其中Ⅰ组培养液成份为与第一部分实验相同的基础培养液;Ⅱ组为基础培养液加100ng/ml的IGF-Ⅰ;Ⅲ组为基础培养液加0.01mmol/L的EGCG;Ⅳ组为基础培养液同时加入100ng/ml的IGF-Ⅰ和0.01mmol/L的EGCG。将这四组培养瓶保存于第一步得出的最佳温度与液体处理条件中。分别检测新鲜、7天、21天、42天、56天之后组织细胞的存活率、HE、番红-O染色及Ⅱ型胶原SABC-FITC免疫荧光染色。分析各组保存效果。结果第一部分，除保存7天时温度因素，以及温度与液体处理两因素交互作用对细胞存活率没有影响之外，其余各时间点的温度因素、液体处理因素及温度与液体处理两因素交互作用都对细胞存活率的变化产生了影响，其中保存7天、21天、35天时细胞存活率最高值分别为90.88±3.69%、88.31±3.93%、78.69±8.56%，均出现在4℃条件下换液保存组。对各组番红-O的分析除了保存7天时A组IOD值明显高于其他三组外，其他保存时间点IOD值组间比较无显著差异。各组保存效果随着时间的延长出现了明显的下降趋势，且下降速率从保存21天起迅速增加。因此，4℃条件下换液保存法保存骨软骨组织效果比37℃、不换液效果好。第二部分，保存7天时，基础培养液组（Ⅰ）、基础培养液+IGF-Ⅰ组（Ⅱ）、基础培养液+EGCG组（Ⅲ）细胞存活率组间无明显差别，均从新鲜的87.45±3.59%降至81%左右，基础培养液+EGCG+IGF-Ⅰ组（Ⅳ）为63.72±12.42%，出现明显下降;保存21天时，后二组细胞存活率下降明显,分别低至70.17±3.88%和64.69±5.63%，明显低于前两组的78.58±3.10%和80.41±3.87%;保存42天和56天时，各组各检测指标均出现大幅下降，降至20%左右，组间差别不大，已无分析意义。对番红-O染色和Ⅱ型胶原染色也表现出了相同的差别与变化趋势。各组保存效果随着时间的延长出现了明显的下降趋势，且下降速率从保存21天起迅速增加。因此，培养液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ没有对体外培养保存骨软骨组织的效果产生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和两种因子同时加入对保存效果产生了有害作用。结论 1、采用4℃条件下保存、每隔2天进行一次换液的处理方式体外液体培养保存骨软骨组织效果比37℃、不换液的方式好;2、培养液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ没有对体外培养保存骨软骨组织的效果产生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和两种因子同时加入对保存效果产生了有害作用。意义关节软骨全层损伤的治疗对骨科和运动医学医生一直是一个难题。异体骨软骨移植治疗较大的全层软骨损伤成为一个有前途的方法。但是由于供体来源有限和移植物微生物学的检测，如何长时间的保存有活性的软骨移植物成为研究者关注的焦点。本实验通过比较不同温度和不同换液条件对液体培养法保存骨软骨组织的效果，选出了一种较为理想的保存温度和液体处理条件，又以这种条件为基础，观察了EGCG与IGF-Ⅰ这两种对液体培养保存软骨有益的成份同时作用对骨软骨组织的影响。为进一步优化培养培养液的成份做出了指导。

关键词：骨软骨异体移植液体培养体外保存

脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）精子和胚胎体外保存的研究

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脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）精子和胚胎体外保存的研究

作者：浦蕴惠南京农业大学

学位级别：硕士

近年来,低温生物学的发展越来越迅速。脊尾白虾作为重要的经济虾之一,在精子和胚胎方面的研究还较少。本论文对脊尾白虾的精子和胚胎体外保存做了相关的研究,为其精子和胚胎的超低温(-196℃)保存筛选了适宜的条件。这些研究为提高脊尾... 详细信息

近年来,低温生物学的发展越来越迅速。脊尾白虾作为重要的经济虾之一,在精子和胚胎方面的研究还较少。本论文对脊尾白虾的精子和胚胎体外保存做了相关的研究,为其精子和胚胎的超低温(-196℃)保存筛选了适宜的条件。这些研究为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论指导,以及为其精子代谢及生理研究提供参考。胚胎的体外保存可以随时为育苗和生产的研究提供材料。以上研究对脊尾白虾种质优选、雌核发育、建立优良种质都具有重要意义。在脊尾白虾精子体外保存的研究中,采用染色法和顶体酶活力两种方法,研究了环境因子对精子活力的影响,当盐度在20-25‰,pH在8.0时,精子的存活率和顶体酶活力较高。在稀释剂和抗冻剂筛选的研究中,稀释剂I-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4d后,稀释剂I组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.80μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著y=0.846(p保存2d后,稀释剂I组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.51μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂I组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(p保存的最佳抗冻剂,此条件下超低温保存2d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.39gIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数y=0.864(p保存对脊尾白虾精子内琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na+/K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)与顶体酶(ACE)活性的影响,以期为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论依据。设置对照组、3个实验组,于冷冻0、1、3、5、7、15d取样测定各酶活性。结果表明,冷冻后,除GR外,其他所测酶活性均出现显著下降p保存中添加抗冻剂是必要的。15%DMSO抗冻剂下细胞DNA损伤最低,低于其它浓度抗冻剂。该研究为深入研究脊尾白虾精子冷冻损伤提供了科学依据。脊尾白虾胚胎体外保存的研究中,研究得出盐度在20-25‰,pH在7.0时,胚胎的存活率最高。筛选的7种稀释剂中,使用BS2溶液时,胚胎的保存效果较好。选取了DMSO、GLY、1,2-PG作为抗冻剂,发现对胚胎的毒性由大到小依次是1,2-PG、 DMSO、GLY,且浓度5%-10%,存活率升高,10%-20%时,保存效果下降。10%GLY为脊尾白虾超低温保存的最佳抗冻剂,在冷冻10d后的存活率为78.94%。在研究超低温冷冻对脊尾白虾胚胎脂肪酸影响时,发现超低温冷冻保存后各组分发生了明显变化。脊尾白虾胚胎中主要含有29种脂肪酸,碳链长度主要是在C14到C24之间,其中饱和脂肪酸(SFAs)有9种,占37.948%,单不饱和脂肪酸(MUFAs)有8种,占30.091%,多不饱和脂肪酸(PUFAs)有9种,占30.763%。冷冻后,饱和脂肪酸中C15：0和C17：0含量明显下降,对照组与实验组差异显著(p<0.05)。C16：0和C18：0的含量显著上升,对照组与实验组差异显著。单不饱和脂肪酸C16：1超低温冷冻后对照组显著上升,其余实验组显著下降,且与新鲜胚胎、对照组差异性显著(p<0.05)。胚胎冷冻后C18：1n9c(顺)显著上升,各组间差异性显著(p<0.05)。多不饱和脂肪酸C18:2n6c在冷冻后,各组间存在显著差异(p<0.05)。DHA含量在冷冻后显著下降,各组间含量存在显著性差异(p<0.05),EPA在冷冻后含量显著下降。Cn-3/Cn-6呈下降趋势。分析结果发现,添加抗冻剂与未添加抗冻剂各组差异显著。

关键词：脊尾白虾精子胚胎体外保存

稀释液溶质组合及渗透压对鸡精子体外保存时间和形态的影响

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甘肃农业大学学报 2008年第3期43卷 60-63页

作者：张兆旺刘孟洲甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州730070

研究了8种稀释液溶质精确的渗透压和用其配制的13种鸡精液稀释液对鸡精子的保存效果.结果显示,无机盐氯化钠、氯化钾在350 mmol/L渗透压浓度单独使用时可以获得较高的精子存活时间和精子生存指数,但不利于维持鸡精子细胞膜的完整性.有... 详细信息

研究了8种稀释液溶质精确的渗透压和用其配制的13种鸡精液稀释液对鸡精子的保存效果.结果显示,无机盐氯化钠、氯化钾在350 mmol/L渗透压浓度单独使用时可以获得较高的精子存活时间和精子生存指数,但不利于维持鸡精子细胞膜的完整性.有机盐柠檬酸钠、柠檬酸钾最佳的渗透压值应该在350- 400 mmol/L.谷氨酸钠最佳渗透压不是等渗,而是偏低渗.3种有机盐溶液对鸡精子形态有保护作用。葡萄糖、蔗糖、果糖单成分液均有保护鸡精子形态完整的良好作用;最适渗透压浓度葡萄糖为250 mmol/L,蔗糖为200- 250 mmol/L.氯化钠和氯化钾以5∶1比例制成350 mmol/L渗透压浓度溶液时可以获得比单独使用时更高的精子存活时间和生存指数,但不能改变无机盐对鸡精子细胞膜的破坏作用.250 mmol/L谷氨酸钠和450 mmol/L的果糖以1∶2组合后可以获得较为理想的鸡精子机能和形态保存效果.

关键词：鸡稀释液渗透压体外保存精子形态