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嗜热藻BP-1中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

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植物科学学报 2013年第2期31卷 178-185页

作者：刘冰冰陈煜邓明刚赵开弘周明华中农业大学生命科学技术学院武汉430070 华中科技大学环境科学与工程学院武汉430074 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

通过蛋白质序列同源性比对分析,在嗜热藻(Thermosynechococcus elongatus BP-1)里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的3个基因tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,与可生成藻蓝胆素(PCB)的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA在大肠杆菌BL21(DE3)体内重组,生成重组蛋白,利用亲和层析柱分离纯化,纯化后的蛋白质经过锌荧光和蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定,结果表明,Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406 nm和绿光吸收态Pg527 nm之间的可逆光转换,它可共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素(PVB)和藻蓝胆素(PCB),Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417 nm和青光吸收态Pt496 nm之间的可逆光转换,它同样共价结合PVB和PCB,而Tlr1215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光活性。

关键词：蓝细菌光敏色素可逆光转换体内重组

集胞藻ApcA和CpcA的体内生物重组研究

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武汉理工大学学报 2011年第4期33卷 43-46页

作者：刁红丽周婷赵开弘华中科技大学生命科学与技术学院武汉430074 武汉理工大学资源与环境工程学院武汉430070 华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

利用聚合酶链式反应(PCR)克隆出集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803变藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基的编码基因apcA和cpcA,将脱辅基蛋白ApcA、CpcA分别与裂合酶CpeS1或CpcE/F以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达。研... 详细信息

利用聚合酶链式反应(PCR)克隆出集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803变藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基的编码基因apcA和cpcA,将脱辅基蛋白ApcA、CpcA分别与裂合酶CpeS1或CpcE/F以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达。研究表明:通过大肠杆菌体内重组可以获得具有光学活性的重组色素蛋白PCB-ApcA和PCB-CpcA。吸收光谱、荧光光谱以及锌电泳均表明,藻蓝胆素与脱辅基蛋白形成了正确的共价连接。由此可知,利用大肠杆菌进行集胞藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白α亚基的体内生物合成是可实现的。同时还对重组色素蛋白的摩尔消光系数和荧光量子产率进行了计算。

关键词：集胞藻藻蓝胆素藻蓝蛋白变藻蓝蛋白体内重组

集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

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华中师范大学学报（自然科学版） 2013年第3期47卷 397-403页

作者：朱超陈思礼中南民族大学生命科学学院武汉430074

在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpeS具有高度同源性的基因slr2049.采用PCR从Synechocystis sp.PCC 6803DNA中扩增出cpcB,slr2049,ho1,pcyA4个基因;定点突变试剂盒构建8个突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)和slr2049(Y124S);将它们与表达载体pCDFDuet-1和pET-23a(+)相连构建pCDF-cpcB-slr2049野生型和pCDF-cpcB-slr2049突变体以及pET-ho1-pcyA,进行高效表达,用亲和层析柱纯化,产物用SDS-PAGE和光谱检测.研究表明:突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(Y124S)与野生型slr2049催化获得的重组藻蓝蛋白β亚基具有与天然藻蓝蛋白β亚基相似的光谱特性,其他2个突变体slr2049(A24S)和slr2049(R107S)催化的产物则没有光谱特性.由此推测,第24位丙氨酸和第107位精氨酸可能是slr2049酶活性的必需氨基酸,其所处位置是slr2049的活性位点.

关键词：色素裂合酶藻蓝蛋白-β亚基定点突变体内重组

蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

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蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究

作者：刘冰冰华中农业大学

学位级别：硕士

植物光敏色素是一种光受体,含有线性四吡咯生色团的水溶性蛋白质,具有可逆光转换效应。近年来研究发现光敏色素也存在于细菌和真菌中。蓝细菌光敏色素是一类共价结合藻胆色素发色团的光谱多变的光受体家族,它们的光谱变化几乎覆盖了近紫... 详细信息

植物光敏色素是一种光受体,含有线性四吡咯生色团的水溶性蛋白质,具有可逆光转换效应。近年来研究发现光敏色素也存在于细菌和真菌中。蓝细菌光敏色素是一类共价结合藻胆色素发色团的光谱多变的光受体家族,它们的光谱变化几乎覆盖了近紫外/可见光区,与植物光敏色素有较远的亲缘关系,且只存在于蓝细菌内。蓝细菌光敏色素还可能涉及到昼夜节律和细胞聚集的光感应重新组合。研究表明,单独的GAF结构域与生成藻胆色素的基因在大肠杆菌中共表达,可获得与蓝细菌光敏色素全蛋白的光化学性质相似的色素蛋白。 Thermosynechococcus elongatus BP-1中含有蓝细菌光敏色素数量比较少,且它们是热稳定的,通过蛋白质序列同源性比对分析,在它里面找到了与已知的Pb/Pg型蓝细菌光敏色素TePixJ和TeTlr0924同源的4个基因tll0899、tlr0911、tlr1215和tlr1999。通过分子克隆技术把它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,与质粒pACYCDuet-hol-pcyA在大肠杆菌体内重组生成重组蛋白。实验结果表明,Tll0899-GAF具有光化学活性可共价结合藻蓝胆素(PCB),Tlr0911-GAF存在蓝光吸收态Pb406nm和绿光吸收态Pg527nm之间的可逆光转换,Tlr1999-GAF则存在蓝光吸收态Pb417nm(?)青光吸收态Pt496nm之间的可逆光转换,它们均共价结合两种藻胆色素,即藻紫胆素(PVB)和藻蓝胆素(PCB),Tlr0911-GAF和Tlr1999-GAF均在蓝光区和绿光区有吸收可称之为蓝/绿光受体。该实验表明Tlr0911(?)口Tlr1999的GAF结构域可能具有3个活性功能,即为自催化裂合酶活性,自催化异构酶活性,光致异构化活性。而Tlrl215-GAF1和Tlr1215-GAF2不能自发结合藻胆色素,不具有光化学活性。在对Synechococcus sp.CC9311中仅有的两个推测的蓝细菌光敏色素Sync012和Sync604研究中,将它们的GAF结构域分别构建在pET30a(+)表达载体上,单独诱导表达或与质粒pACYCDuet-hol-pcyA在大肠杆菌体内重组后表达,得到水溶性较低的蛋白质,通过加入尿素促溶,经过实验验证,Sync012-GAF和Sync604-GAF不能与藻胆色素共价结合,但是它们可能与核黄素等大肠杆菌体内的色素结合,这还需要进一步的研究。根据Nostoc sp. PCC7120中所有的GAF结构域氨基酸序列信息进行蛋白质聚类分析,利用生物软件Clustal X1.83和MEGA version5.0做出Nostoc sp. PCC7120中GAF结构域进化树示意图,发现一个含有保守性的DXCF基序的光受体分支,以及其它一些同源性较高的光受体分支。利用分子生物学技术构建GAF结构域的表达质粒,分别将各种表达质粒与催化藻蓝色素生物合成的质粒pACYCDuet-hol-pcyA同时转入大肠杆菌BL21体内重组,诱导表达生成重组蛋白。发现2个具有可逆光转换效应的含DXCF基序的蓝细菌光敏色素A111688和Alr1966,All1688-GAF主要结合PCB,其可逆光转换效应比较微弱,它的Pg态和Pb态的吸收光谱具有重叠现象;Alr1966-GAF2共价结合PVB和PCB,有3种光状态：Pg态、中间态和Pb态,它具有顺序光可逆循环。另一个由All4978-GAF、All7016-GAF和Alr7522-GAF组成的光受体分支,其中Alr7522-GAF不具有光化学活性,而其余2个具有性质相似的光化学活性,但是不具备可逆光转换效应,根据其吸收光谱推测它们结合的色素可能为血红素。通过蛋白质序列同源性和相似性比对分析,发现Synechocystis sp. PCC6803中sll1888、sll1228、sll1124基因编码的蛋白质分别与Slr1393、Sl10041、UirS(基因为slr1212)具有同源性。利用分子生物学技术构建这3个基因GAF结构域的表达质粒,分别将表达质粒与质粒pACYCDuet-ho1-pcyA同时转入大肠杆菌BL21中共表达生成重组蛋白,实验结果显示,它们并不能结合藻胆色素,不具有光化学活性。

关键词：蓝细菌光敏色素体内重组 GAF结构域可逆光转换蓝/绿光受体

集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

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集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

作者：朱超中南民族大学

学位级别：硕士

2006年，Zhao等在鱼腥藻Anabaena sp. PCC7120中发现了一种色素裂合酶基因cpeS (编号为alr0617)，该基因编码的色素裂合酶CpeS可以催化藻蓝胆素(PCB)连接到藻蓝蛋白或者藻红蓝蛋白的β亚基Cys-84位点上。经过同源软件的分析，在集胞藻Sy... 详细信息

2006年，Zhao等在鱼腥藻Anabaena sp. PCC7120中发现了一种色素裂合酶基因cpeS (编号为alr0617)，该基因编码的色素裂合酶CpeS可以催化藻蓝胆素(PCB)连接到藻蓝蛋白或者藻红蓝蛋白的β亚基Cys-84位点上。经过同源软件的分析，在集胞藻Synechocystis sp. PCC6803中，找到了基因slr2049，它和基因cpeS具有很高的同源性。本实验室已经对基因slr2049的功能有了初步的研究，证明该基因所编码蛋白是具有与其同源蛋白CpeS有相似的功能，即也是一种色素裂合酶。为了进一步的对该基因的结构与功能的相互关系有深刻的了解，本实验运用定点突变技术，对蛋白Slr2049的某些氨基酸位点进行点突变。针对的氨基酸位点是通过比对软件，让Slr2049和其他六种有相同功能的蛋白CpeS蛋白序列进行对比，得到的22个保守性的氨基酸位点中选取八个，选取这些氨基酸位点同时也考虑它们的结构特点与理化性质。在大肠杆菌中合成具有荧光性的藻蓝蛋白β-亚基的需要另外的3个相关基因：血红素加氧酶1基因(ho1)，藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因(pcyA)以及脱辅基蛋白β亚基基因(cpcB)。首先通过改进的提取DNA的方法来提取集胞藻PCC6803的总DNA，再设计引物同时在引物上加入相应的酶切位点，进行PCR得到目的片段;构建野生型slr2049和八个突变体slr2049以及上述三个相关基因的克隆质粒，将以上的这些基因两两结合构建成表达质粒pCDF-cpcB-slr2049野生型和八个pCDF-cpcB-slr2049突变体以及pET-ho1-pcyA，然后将野生型和突变体的表达质粒分别与pET-ho1-pcyA共转化入大肠杆菌BL21体内，让它们进行异源体内重组，通过IPTG的诱导，得到了重组蛋白;由于载体上自带了组氨酸标记，得到的野生型重组蛋白和突变体的重组蛋白可用镍柱亲和层析的方法进行纯化，再把它们分别进行光谱测定。 SDS-PAGE和光谱测定的实验结果显示，野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/slr204-9(Y124S)催化的重组蛋白分别在623nm和640nm左右有最大吸收峰和荧光发射峰，与天然的蛋白的最大吸收峰和荧光发射峰分别在625nm和645nm相近;而突变体slr2049(A24S)/slr2049(R107S)所催化的重组蛋白则没有出现最大吸收峰和荧光发射峰;突变体slr2049(L23S)/slr2049(W72L))/slr2049(G84S)所催化的重组蛋白虽然有吸收峰，但是吸收峰处的最大值与野生型slr2049催化的重组蛋白的吸收峰值相比明显要小很多。可知野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S）、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、 slr2049(R107S)、slr2049(Y124S)之间是有光谱吸收峰值差异的，这可以说明这八个突变位点对催化形成藻蓝蛋白β亚基的能力也是有差异的。从光谱图上可说明24、107位的丙氨酸和精氨酸是色素裂合酶必需氨基酸，是其酶活中心;21、25、124位的组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸对色素裂合酶的催化作用无明显影响，不是必需氨基酸;23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的关键位点，这三个氨基酸的突变能影响它的活性，降低它的催化能力。造成这一差异可能的原因是氨基酸的定点突变能造成蛋白的结构和溶解性改变，从而影响了蛋白的催化能力。为了了解上述的重组蛋白是否是有效表达的，同时证明另外两个突变体有没有进行有效的表达，用特殊制作的一抗，进行Western blot反应。通过SDS-PAGE和Western blot技术对各表达蛋白进行了检测和验证。结果发现，由野生型slr2049和突变体slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/sl-r2049(Y124S)催化形成的蛋白是藻蓝蛋白β亚基，其得到了很好的表达，没有出现缺失，而突变体slr2049(A24S)/slr2049(R107S)没有催化形成藻蓝蛋白β亚基，证明它们是没有色素裂合酶的活性的,这两个位点对色素裂合酶的催化功能是很重要的。

关键词：色素裂合酶定点突变体内重组 Western blot

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层理鞭枝藻藻蓝蛋白β亚基的体内重组

武汉大学学报（理学版） 2006年第4期52卷 481-486页

作者：赵金梅朱菁萍王锋周明赵开弘华中科技大学环境科学与工程学院湖北武汉430074

为研究藻蓝蛋白β亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pET-cpcB(C155I)、pCDFDu-et-cpeS和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpeS、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和藻蓝蛋白β脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)共同转... 详细信息

为研究藻蓝蛋白β亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pET-cpcB(C155I)、pCDFDu-et-cpeS和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpeS、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和藻蓝蛋白β脱辅基蛋白基因cpcB(C155I)共同转入大肠杆菌.通过色素蛋白锌电泳和光谱检测,结果表明产生了有生物活性的CpcB(C155I)-PCB.而在裂合酶基因cpeS不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有7.6%的CpcB(C155I)-PCB产生.实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白β亚基84位半胱氨酸残基与PCB连接,为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础.

关键词： C-藻蓝蛋白藻蓝蛋白β脱辅基蛋白裂合酶基因cpeS 体内重组

细菌光敏色素PCB-AphA(26-320)体内重组与条件优化

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华中师范大学学报（自然科学版） 2008年第4期42卷 606-611页

作者：陈思礼苏平胡勋周明华中科技大学环境科学与工程学院武汉430074 中南民族大学生命科学学院武汉430074 湖北师范学院生命科学学院湖北黄石435002 华中农业大学农业微生物国家重点实验室武汉430070

为验证鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）异源体内重组的可行性，并获取光化学活性高、表达量大的细菌光敏色素，通过多个目的蛋白在单个大肠杆菌细胞体内共表达的方式，促使鱼腥藻PCC7120细菌光敏... 详细信息

为验证鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）异源体内重组的可行性，并获取光化学活性高、表达量大的细菌光敏色素，通过多个目的蛋白在单个大肠杆菌细胞体内共表达的方式，促使鱼腥藻PCC7120细菌光敏色素脱辅基蛋白AphA（26—320）与藻蓝胆素（PCB）的在异源细胞内进行自催化连接．吸收光谱所产生的可逆光致变色效应显示，AphA（26—320）与藻蓝胆素进行了正确的体内重组，AphA（26—320）脱辅基蛋白与藻蓝胆素在体内完成了自催化共价连接；在此过程中还发现：在生长浓度达到OD600=0．6时，冰浴30min，一次性加入终浓度为1mmol／L的IPTG，于30℃，摇床速度为100r／min的条件下诱导表达12～15h可取得较好的效果．

关键词：细菌光敏色素体内重组自催化连接表达条件

鱼腥藻PCC7120核膜连接蛋白ApcE体内重组研究

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武汉植物学研究 2006年第4期24卷 287-291页

作者：贾丽莉周明苏平赵开弘华中科技大学环境科学与工程学院武汉430074

为了研究鱼腥藻PCC7120核-膜连接蛋白ApcE(1-240)脱辅基蛋白与藻蓝胆素的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-ApcE(1-240)。吸收光谱、荧光光谱分析表明,核-膜连接蛋白ApcE(1-240)与藻蓝胆素进行了正确的体内重组。ApcE(1-240)... 详细信息

为了研究鱼腥藻PCC7120核-膜连接蛋白ApcE(1-240)脱辅基蛋白与藻蓝胆素的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-ApcE(1-240)。吸收光谱、荧光光谱分析表明,核-膜连接蛋白ApcE(1-240)与藻蓝胆素进行了正确的体内重组。ApcE(1-240)脱辅基蛋白可与藻蓝胆素体内自催化共价连接,获得的色素蛋白溶于含有4 mol/L尿素的磷酸钾缓冲体系中,并具有最大吸收峰(λm ax=660 nm)和荧光发射峰(λm ax=668 nm)。

关键词：藻胆体藻蓝胆素 ApcE 体内重组自催化连接

鱼腥藻PCC7120藻红蓝蛋白α亚基体内重组研究

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武汉植物学研究 2006年第6期24卷 493-497页

作者：滕吟周明陈芳赵开弘华中科技大学环境科学与工程学院武汉430074

为了研究藻红蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的4种重组质粒pETDuetp-ecA、pCOLADuet-pecE、pCDFDuetp-ecF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因pecE和pecF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻红蓝蛋白α... 详细信息

为了研究藻红蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的4种重组质粒pETDuetp-ecA、pCOLADuet-pecE、pCDFDuetp-ecF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因pecE和pecF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻红蓝蛋白α亚基基因pecA共同转入大肠杆菌BL21(DE3),通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的PecA-PCB。结果表明生成的色素藻胆蛋白具有藻红蓝蛋白α-亚基所特有的光谱性质和可逆光致变色性质。而在裂合酶基因pecE和pecF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.1%的PecA-PCB产生。以上研究对藻胆蛋白生物构建具有重要意义。

关键词：藻红蓝蛋白 PecA pecE pecF 体内重组