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体内转染黄芪来源miR-396可抑制哮喘小鼠Th2细胞的GATA-3表达

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中国免疫学杂志 2019年第24期35卷 3001-3007页

作者：沈朝斌郁兰顾燕妮王嵩陆磊上海中医药大学附属上海市中西医结合医院

目的:微小RNA(miRNAs)是一类对基因转录后调节起关键作用的小的非编码RNA。黄芪主要用于调节免疫功能。本次研究采用合成黄芪来源的miR-396拟似物(mimic)体内转染后对哮喘小鼠Th2细胞的抑制作用。方法:选择健康雄性BALB/c小鼠40只,分对... 详细信息

目的:微小RNA(miRNAs)是一类对基因转录后调节起关键作用的小的非编码RNA。黄芪主要用于调节免疫功能。本次研究采用合成黄芪来源的miR-396拟似物(mimic)体内转染后对哮喘小鼠Th2细胞的抑制作用。方法:选择健康雄性BALB/c小鼠40只,分对照组、哮喘模型组、转染组、地塞米松治疗组,每组10只。用OVA诱导和激发小鼠制作哮喘模型。在完成第2次OVA激发后,转染组每只小鼠隔天经鼻滴入miR-396拟似物200 ng,共7次。治疗对照组给予腹腔注射地塞米松。实验后第58天处死小鼠,转染组采用RT-PCR检测肺组织、外周血和脾脏miR-396表达;同时测定各组脾脏匀浆单个核细胞中的T-bet、STAT-6、GATA-3、ROR-γt和Foxp3;采用ELISA测定各组肺匀浆中IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β和IFN-γ水平;光镜下观察肺组织病理学改变。结果:转染组小鼠肺组织miR-396为内参基因U6表达量的(10.69±1.27)倍;脾脏表达量为的(13.87±2.05)倍;外周血的表达量为(12.62±1.65)倍。miR-396转染组与哮喘模型组肺部细胞因子比较,IFN-γ水平显著提高(P转染组IL-5、IL-13水平均显著低于哮喘模型组(P值均转染组IL-17A水平被显著抑制(P转染后显著降低了哮喘Th2细胞GATA-3 mRNA表达水平和Th17细胞ROR-γt mRNA的表达,但对抑制Th17细胞ROR-γt mRNA表达作用弱于地塞米松治疗组;miR-396转染对T-bet、STAT-6和Foxp-3 mRNA表达均无显著作用(P>0.05)。miR-396转染组肺部病理改变提示炎症状况得到缓解。结论:本研究结果证实了经鼻滴入转染方法可使哮喘小鼠脾脏、外周血和肺组织均高表达植物来源的miR-396。研究表明,转染miR-396拟似物可抑制Th2细胞炎症因子IL-5和IL-13,显著降低Th2细胞的主要转录因子GATA-3。黄芪来源的miR-396可作为一种哮喘治疗策略加以深入研究。

关键词：体内转染黄芪微小RNA-396 哮喘动物模型

人类超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因体内转染大鼠心脏进行生物起搏的初步研究

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中华心血管病杂志 2007年第3期35卷 275-276页

作者：张萍郭继鸿钟幼民李继文刘元伟张幼怡周春燕北京大学人民医院心内科教育部分子心血管重点实验室 100044 北京大学第三医院血管医学研究所北京大学基础医学院生化研究室

严重的缓慢性心律失常往往需要置入电子起搏器。然而，电子起搏器自身存在一些局限性。近年来，人们开始探索采用基因治疗和细胞治疗技术构建生物起搏器。目前，构建生物起搏器的策略有多种，其中以通过增强起搏电流（pacemaker current... 详细信息

严重的缓慢性心律失常往往需要置入电子起搏器。然而，电子起搏器自身存在一些局限性。近年来，人们开始探索采用基因治疗和细胞治疗技术构建生物起搏器。目前，构建生物起搏器的策略有多种，其中以通过增强起搏电流（pacemaker current，If）来构建生物起搏器的策略最受关注。If的分子基础是超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（hyperpolarization—activated cyclic nucleotide-gated cation channel，HCN）。本研究的目的是探讨利用人类HCN2（hHCN2）转染到大鼠心脏中进行生物起搏的可行性、安全性和时效性。

关键词：超极化激活环核苷酸门控阳离子通道生物起搏器大鼠心脏体内转染离子通道基因人类缓慢性心律失常 channel

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白两种途径体内转染大鼠角膜基质细胞有效性的试验研究

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激光杂志 2011年第2期32卷 57-59页

作者：宾莉杜之渝许寅聪重庆医科大学附属第二医院眼科中心重庆400010

目的:观察慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)通过两种途径体内转染大鼠角膜基质细胞的有效性,为角膜疾病尤其是准分子激光术后角膜Haze形成的基因治疗提供实验基础。方法:Lenti-EGFP通过角膜基质注射和刮除角膜上皮敷贴带... 详细信息

目的:观察慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)通过两种途径体内转染大鼠角膜基质细胞的有效性,为角膜疾病尤其是准分子激光术后角膜Haze形成的基因治疗提供实验基础。方法:Lenti-EGFP通过角膜基质注射和刮除角膜上皮敷贴带lenti-EGFP的棉片两种不同方法体内转染大鼠角膜基质细胞,转染后定期裂隙灯观察,进行眼前节照相,以3d、7d、26d、48d四个不同时间点收集角膜,固定后切片,共聚焦显微镜观察。结果:两组转染了lenti-EGFP的角膜2d后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)开始表达,7d时达到高峰,26d时表达明显减弱,48d时仅有微弱表达,空质粒组和对照组的角膜基质细胞在各时间段均未见荧光表达。结论:Lenti-EGFP通过上述两种转染途径均可有效的转染角膜基质细胞。

关键词：慢病毒角膜基质体内转染绿色荧光蛋白

鸭胚胎血液中PGCs数量及其外源DNA的体内转染

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厦门大学学报（自然科学版） 2002年第5期41卷 623-627页

作者：叶荣忠张彦定高建民郭小玲福建师范大学生物工程学院福建福州350007 厦门大学海洋与环境学院福建厦门361005

抽取了麻鸭和骡鸭胚胎发育第 14～ 2 0期的血液 ,制作血涂片 ,PAS染色 .观察血液中的原生殖细胞的含量 ,并对各个时期血液中原生殖细胞的含量进行了统计 ,最高含量都出现在第 16期 ,分别为 8.975 2 %和 2 .1871% .用InvivoGeneDeliveryS... 详细信息

抽取了麻鸭和骡鸭胚胎发育第 14～ 2 0期的血液 ,制作血涂片 ,PAS染色 .观察血液中的原生殖细胞的含量 ,并对各个时期血液中原生殖细胞的含量进行了统计 ,最高含量都出现在第 16期 ,分别为 8.975 2 %和 2 .1871% .用InvivoGeneDeliverySystem和 pEGFP N对PGCs进行了外源DNA的体内转染 .结果在 6只胚胎中的

关键词：胚胎血液 PGCs 外源DNA 体内转染麻鸭骡鸭原生殖细胞胚胎发育细胞数量基因转移

人结肠癌来源的肿瘤体内转染腺病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨后对5-FC敏感性增高

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国际肿瘤学杂志 1996年第2期 115-116页

作者：黄欣

癌症基因治疗中的一个基本策略是局部控制肿瘤生长,体内基因转染可以使目的基因集中在靶组织内,用这一方法可以转染一些编码酶的基因,当它们在肿瘤细胞内或周围组织中表达时,一些全身应用的非抗肿瘤的低毒性药物在这一局部被代谢成抗肿... 详细信息

癌症基因治疗中的一个基本策略是局部控制肿瘤生长,体内基因转染可以使目的基因集中在靶组织内,用这一方法可以转染一些编码酶的基因,当它们在肿瘤细胞内或周围组织中表达时,一些全身应用的非抗肿瘤的低毒性药物在这一局部被代谢成抗肿瘤的具有较高毒性的产物,使其在肿瘤局部发挥作用,并避免了全身毒性。胞嘧啶脱氨酶(CD)是这类基因中的一种。为观察体内转染

关键词：转染率肿瘤生长 FC 体内转染腺病毒旁观者效应大肠杆菌大肠埃希氏菌埃希氏杆菌属胞嘧啶核酸碱基

克隆鸭乙型肝炎病毒DNA双体体内转染的研究

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中国病毒学 1997年第1期12卷 66-70页

作者：邓卫文谢弘闻玉梅中国科学院上海细胞生物学研究所上海上海医科大学分子病毒学实验室

用一种含头尾相连DHBVDNA双体的质粒体内转染2日龄芙蓉鸭，大多数鸭（86％）产生了短暂病毒血症。血清DHBs／preSAg和DHBVDNA于转染后第9天出现，第12～14天达峰值，第28天时多数转阴；少数鸭的病毒血症可持续50天以上。转染鸭肝组织中... 详细信息

用一种含头尾相连DHBVDNA双体的质粒体内转染2日龄芙蓉鸭，大多数鸭（86％）产生了短暂病毒血症。血清DHBs／preSAg和DHBVDNA于转染后第9天出现，第12～14天达峰值，第28天时多数转阴；少数鸭的病毒血症可持续50天以上。转染鸭肝组织中也检测到复制中间型DHBVDNA的存在。用转染鸭病毒血症期的血清作磷钨酸负染电镜观察，找到了完整的DHBV病毒颗粒，并且用此血清腹腔注射1日龄鸭，60％的鸭被感染成功，证明体内转染后有生物活性的DHBV病毒颗粒的产生。该研究方法的建立．对于研究DHBV变异株．DHBV基因结构与功能的关系等，均有一定理论意义及应用价值。

关键词：鸭乙型肝炎病毒 DNA双体体内转染动物模型

联合基因治疗骨关节炎：IL-1Ra联合自杀基因HSV-TK体内转染治疗兔膝骨性关节炎的实验研究

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联合基因治疗骨关节炎：IL-1Ra联合自杀基因HSV-TK体内转染治疗兔...

作者：李艳山东大学

学位级别：硕士

研究目的骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是老年人群发病率较高的疾病之一,是在全身因素和局部因素的综合作用下,关节软骨发生生化、结构和代谢改变,最终出现关节软骨软化、破溃和局部剥脱以及关节边缘骨与软骨赘生物形成等病理改变,临... 详细信息

研究目的骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是老年人群发病率较高的疾病之一,是在全身因素和局部因素的综合作用下,关节软骨发生生化、结构和代谢改变,最终出现关节软骨软化、破溃和局部剥脱以及关节边缘骨与软骨赘生物形成等病理改变,临床上可产生关节疼痛、活动受限和关节畸形等症状,严重影响老年人的身体健康,是致残的重要原因。在骨关节炎的病理改变中,大量炎性介质的产生和释放是造成局部关节改变的重要因素。其中IL-1和TNF-a是OA病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子,其他细胞因子对关节软骨的破坏往往是间接通过IL-1和TNF-a发挥作用。目前国内外对OA的发病机制和治疗研究很多,但疗效不尽如人意,近些年来自杀基因治疗为骨关节炎的治疗提供了一种新的方法。本实验中,我们应用基因治疗的方法,利用重组重组腺相关病毒载体(rAAV),将外源性抑炎性因子基因联合自杀基因直接体内转染兔膝关节后,观察对骨关节炎的治疗效果。有可能在骨关节炎的治疗上去的新的进展。方法采用切断并切除前交叉韧带及内侧半月板的方法将32只新西兰白兔的右后膝关节制成OA的动物模型,将兔子平均分成四组,将有rAAV包装的目的基因通过髌韧带注射入关节腔内,A组]AAV2/1-IL-1Ra1ml,B组rAAV2/1-HSV-tk1ml,C组rAAV2/1-TK-IL-1Ra lml,D组为对照组,转染含空质粒的rAAV2/11mL关节腔内注射24小时后,每只动物给予静脉内注射更昔洛韦(GCV)5mg／天,一天两次,持续三天。注射后第7天,用lml生理盐水灌洗关节腔,抽取关节腔灌洗液用ELISA分析外源基因的表达情况,注射后第14天,处死动物,用无菌生理盐水1ml灌洗关节腔,抽取关节灌洗液进行IL-1β、TNF-a及TGF-β1的ELISA分析,取滑膜组织通过real-time PCR方法检测目的基因的表达,并用相对定量的方法—2-ΔΔCT进行目的基因表达的分析,目的基因包括：IL-1β、TNF-α、及TGF-β1。取关节标本进行固定,包埋,切片和HE染色及番红O染色,镜下观察软骨细胞排列情况,并进行软骨组织学评分。结果通过ELISA检测分析接受IL-1Ra基因治疗的A组及IL-1Ra联合HSV-tk基因治疗的C组在外源基因注射后第7天和第14天,关节液内有稳定的外源基因IL-1Ra的表达,而转染HSV-tk基因的B组及未有基因转染的对照组D组未检测到人IL-1Ra的表达。说明外源基因能在关节腔内表达。通过real-time PCR检测目的基因的表达量,IL-1β的表达量三个实验组明显低于对照组,此外C组即IL-1Ra联合HSV-tk基因治疗组明显低于A组IL-1Ra基因治疗组和B组HSV-tk基因治疗组,差别有统计学意义;TNF-α的表达量对照组高于三个实验组,联合基因治疗组低于单基因治疗组,差别有统计学意义;TGF-β1的表达量对照组明显高于三个实验组。通过ELISA检测,IL-1β在A组、B组、C组的水平明显低于对照组D组,TNF-α的表达水平在对照组明显高于三个治疗组,差别有统计学意义;TGF-β1水平对照组明显高于导入外源性基因的A、B、C三组,统计结果以平均值±SEM表示,n=3,P转染基因的对照组关节软骨表面粗糙并有软骨剥脱,外源性基因导入后,软骨损害及软骨基质降解明显减轻。关节软骨的Mankin's评分显示对照组的评分8.264±0.044明显高于三个基因治疗组,而联合基因治疗组的评分明显低于两组单一基因治疗组。结论我们将携带目的基因的重组腺相关病毒载体注射入关节腔内,进行体内转染试验,使其在体内表达相应的目的基因。根据实验结果我们发现,IL-1Ra基因联合自杀基因HSV-tk对于骨关节炎的基因治疗优于单纯的使用IL-1Ra基因或HSV-tk基因治疗,不仅可以有效地减少主要促炎性因子—IL-16的含量,减轻滑膜炎症,同时还可以减轻软骨损害和软骨基质降解,以此来达到治疗骨关节炎的目的。

关键词：骨关节炎基因治疗自杀基因体内转染炎性介质

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白两种途径体内转染大鼠角膜基质细胞的实验研究

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慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白两种途径体内转染大鼠角膜基质...

作者：宾莉重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:观察以慢病毒作为载体,介导增强型绿色荧光蛋白（lenti-EGFP）这一报告基因,通过两种方式体内转染大鼠角膜基质细胞的有效性和安全性,探索一种简便,有效且安全的转染载体及途径,为角膜相关疾病的基因治疗提供实验基础。方法:L... 详细信息

目的:观察以慢病毒作为载体,介导增强型绿色荧光蛋白（lenti-EGFP）这一报告基因,通过两种方式体内转染大鼠角膜基质细胞的有效性和安全性,探索一种简便,有效且安全的转染载体及途径,为角膜相关疾病的基因治疗提供实验基础。方法:Lenti-EGFP通过两种不同方法体内转染大鼠角膜基质细胞,途径1:将Lenti-EGFP病毒液通过微量进样器直接注射进角膜基质;途径2:刮除角膜上皮,基质层敷贴浸带有等量lenti-EGFP病毒液的棉片。转染后定期裂隙灯检查,观察角膜绿色荧光的表达及外眼情况,以3d、7d、26d、48d四个不同时间点收集角膜,固定后切片,进行HE染色,观察角膜各层细胞的大体形态;共聚焦显微镜观察拍照,了解角膜荧光表达的强度、持续时间及分布情况;电镜观察基质细胞超微结构的变化;细胞凋亡检测,了解试验组与对照组角膜细胞凋亡情况。结果:1.裂隙灯古兰光下见转染lenti-EGFP的活体大鼠角膜成蓝绿色,对照组角膜未见荧光表达。***染色显示各组别大鼠角膜的各层细胞形态未发生明显异常改变,电镜见实验组角膜基质细胞的超微结构未发生变异。3.共聚焦显微镜下观察见:转染lenti-EGFP的角膜基质细胞2d后增强型绿色荧光蛋白（EGFP）开始表达,7d时荧光表达到高峰,全层角膜均可见荧光表达,26d时表达明显减弱,48d时仅是上皮有微弱表达;空质粒组在第3d和7d时角膜上皮及基质层间可见微弱荧光,基质细胞中无荧光表达,26d和48d时角膜已无荧光表达;对照组的全层角膜在各时间段均未见荧光表达。***检测发现实验组的角膜上皮及基质细胞凋亡率较正常组高,但与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:Lenti-EGFP通过上述两种体内转染途径均可安全有效的转染活体大鼠角膜基质细胞。在转染初期,注射法的EGFP基因表达更强,随着时间的延长两种方式的荧光强度趋于相同,但基质注射途径仍略强于刮除上皮敷贴棉片这种方式。两种技术操作简便、基因转染快速,且转染效率较高、安全性好,为各种原因导致的角膜病变,尤其是对抑制准分子激光术后角膜Haze形成及板层角膜移植术后的排斥反应等转基因治疗提供了新思路。

关键词：慢病毒角膜基质体内转染绿色荧光蛋白

nm23—H1体内转染抑制LCI-D20的转移

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中华肝脏病杂志 1999年第3期07卷 179-180页

作者：陈方国林芷英李晓明上海医科大学肝癌研究所!２０００３２