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珊瑚来源的β-葡糖苷酶产生菌筛选、基因表达与低聚龙胆糖合成研究

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珊瑚来源的β-葡糖苷酶产生菌筛选、基因表达与低聚龙胆糖合成研究

作者：肖振伦广西大学

学位级别：硕士

β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶,广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,可应用于生产生物燃料、异黄酮元,增强果酒风味以及合成低聚糖。目前因β-葡萄糖苷酶酶活低、葡萄糖耐受性差等因素限制其工业应用,因此寻找高酶活、高葡萄糖耐受性... 详细信息

β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶,广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,可应用于生产生物燃料、异黄酮元,增强果酒风味以及合成低聚糖。目前因β-葡萄糖苷酶酶活低、葡萄糖耐受性差等因素限制其工业应用,因此寻找高酶活、高葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶在应用上具有重要意义。珊瑚共附生微生物种类繁多、数量庞大,可能蕴藏着丰富的β-葡萄糖苷酶产生菌。本研究通过蔗糖密度梯度离心收集和原位模拟的培养方法获得珊瑚共附生微生物,通过功能筛选出β-葡萄糖苷酶产生菌,并对酶基因进行异源表达与酶学性质分析与其合成低聚龙胆糖研究,主要结果如下:(1)通过蔗糖密度梯度离心收集和原位模拟培养获得285株可培养细菌,再通过功能筛选从中得到87株β-葡萄糖苷酶产生菌。在门水平上分别为Proteobacteria(67.82%)、Firmicutes(25.29%)、Actinobacteria(6.89%),其中优势属为Photobacterium sp.(16.09%)和Paracoccus sp.(13.79%)。(2)构建β-葡萄糖苷酶产生菌的总DNA宏基因文库,并通过高通量测序注释功能基因,共获得68个全长糖苷酶水解酶族1(GH1)和84个全长糖苷酶水解酶族3(GH3)的β-葡萄糖苷酶基因。再从GH1和GH3家族中筛选出3个新型β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达。以4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(p NPG)表征酶学性质,重组酶MG132、MG163和MG9373的K分别为1.358 m M、0.319 m M、15.113 m M;酶活力分别为:188.44 U/mg、341.41U/mg、372.23 U/mg;它们在20%的葡萄糖溶液中仍分别保持50%、30%、25%以上的酶活,表现出良好的葡萄糖耐受性。(3)使用重组酶MG163进行低聚龙胆糖合成,其最适合成条件为:40℃,p H7.0,加酶量为21.6 U/g葡萄糖,原料最佳比例为葡萄糖:纤维二糖=30%:15%,合成时间48 h,低聚龙胆糖最高转化率为15.63%。

关键词：珊瑚共附生微生物多样性可培养 β-葡萄糖苷酶异源表达低聚龙胆糖

β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的研究

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β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的研究

作者：刘玲玲江南大学

学位级别：硕士

低聚龙胆糖是葡萄糖通过β-1,6-糖苷键组成的功能性低聚糖,是高效的双歧杆菌增殖因子,有众多优良的生理功能,市场前景广阔。低聚龙胆糖的研究和应用起步晚,但发展很快。工业化生产低聚龙胆糖主要是通过酶法生产,但目前国内仍未能大规模... 详细信息

低聚龙胆糖是葡萄糖通过β-1,6-糖苷键组成的功能性低聚糖,是高效的双歧杆菌增殖因子,有众多优良的生理功能,市场前景广阔。低聚龙胆糖的研究和应用起步晚,但发展很快。工业化生产低聚龙胆糖主要是通过酶法生产,但目前国内仍未能大规模工业化生产。本论文系统地研究了低聚龙胆糖的酶法生产工艺,以高浓度的葡萄糖为原料,利用高活性重组β-葡萄糖苷酶转糖苷和缩合得到低聚龙胆糖浆,再进行分离纯化获得高纯度的低聚龙胆糖成品。主要研究内容如下: 1.将黑曲霉(Aspergillus niger CMI CC324262)β-葡萄糖苷酶的基因bgl连接到载体pPIC9K上,在毕赤酵母(Pichia pastoris) KM71中表达,成功构建了基因工程菌KM 71/bgl/pPIC 9K,表达产物经HPLC、MS鉴定具有转苷活性,可作为低聚龙胆糖的生产用酶。 2.考察基因工程菌KM 71/bgl/pPIC 9K的摇瓶发酵情况,确定适宜的发酵条件:生长阶段接种量10%,甘油初始浓度30 g/L,生长pH6.0,温度30℃。诱导阶段甲醇初始浓度4%,每24 h添加0.5%甲醇,诱导表达周期120 h,诱导pH 7.5,温度30℃,250 mL三角瓶诱导培养基装液量50 mL,酶活可达到245 U/mL。本研究为低聚龙胆糖大规模生产奠定了坚实的基础。 3.基因工程菌KM 71/bgl/pPIC 9K发酵获得β-葡萄糖苷酶粗酶液后,用于转化葡萄糖制备低聚龙胆糖,优化其反应条件。确定最佳条件:底物浓度为80%,反应pH4.5,温度60℃,每克葡萄糖加酶60 U,添加1 mmol/L的K+,转化周期为48 h,低聚龙胆糖浓度为50 g/L。 4.初步研究酶反应产物中低聚龙胆糖的分离纯化。比较结晶、色谱柱两种分离方法,结果表明色谱柱分离法效果较好,最佳分离条件是利用阳离子树脂DTF-02,控制分离柱柱高500 mm,内径16 mm,分离温度50℃,进料量0.25 g低聚龙胆糖,以水为洗脱剂,2 mL/min的洗脱流速,可使低聚龙胆糖含量达到73%,回收率为43%,有望进一步分离得到更为理想的结果,使生产高纯度低聚龙胆糖成为可能。

关键词：低聚龙胆糖 β-葡萄糖苷酶表达发酵条件优化酶转化分离纯化

Thermotoga sp.β-葡萄糖苷酶重组表达、分子改造及制备低聚龙胆糖研究

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Thermotoga sp.β-葡萄糖苷酶重组表达、分子改造及制备低聚龙胆...

作者：盛玲玲江南大学

学位级别：硕士

低聚龙胆糖是一种具有益生功能的新型功能性低聚糖,其含有的β-1,6葡萄糖苷键不易被人体消化降解,有利于双歧杆菌和乳杆菌等肠道微生物的生长。目前只有日本能够大规模生产低聚龙胆糖,我国仍处于起步阶段。一种性能良好的β-葡萄糖苷酶... 详细信息

低聚龙胆糖是一种具有益生功能的新型功能性低聚糖,其含有的β-1,6葡萄糖苷键不易被人体消化降解,有利于双歧杆菌和乳杆菌等肠道微生物的生长。目前只有日本能够大规模生产低聚龙胆糖,我国仍处于起步阶段。一种性能良好的β-葡萄糖苷酶对于生产低聚龙胆糖至关重要。本研究在枯草芽孢杆菌中成功重组表达β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A,对其表达的β-葡萄糖苷酶TsBgl1A生产低聚龙胆糖的条件进行了优化。之后通过定点突变获得三个转化率提高的突变体,结合突变位点的三维空间位置从转苷/水解比、动力学参数等方面分析了突变体转化率提高的原因,最后对最优突变体G224A进行了摇瓶优化和3-L罐发酵条件的初步摸索。主要研究结果如下:(1)热袍菌Thermotoga ***6来源的β-葡萄糖苷酶基因TsBgl1A成功在*** WS11中重组表达。进一步对重组酶的酶学性质进行探究,测得其最适温度和最适pH分别为90℃和6.0,重组酶具有良好的温度稳定性和pH稳定性;重组酶对四种二糖底物和pNPG具有良好的水解活力。(2)分别探究了不同条件对重组酶制备低聚龙胆糖的影响,确定最优酶转化条件:反应温度80℃,pH 6.0,加酶量为500 U·g,底物浓度为1200 g·L,反应时间为24 h,此时的转化率最高可达到14.86%,低聚龙胆糖的最高产量为175 g·L;基于低聚龙胆糖的工业化生产考虑,选择底物浓度为800 g·L的葡萄糖为最佳底物浓度时,重组TsBgl1A制备低聚龙胆糖的转化率为10.41%。(3)通过对重组酶的结构进行分析,发现G224位点极有可能对重组酶的转糖苷活性产生影响,针对该位点设计构建了10种突变体并成功表达。在野生型酶的最佳酶转化条件下,探究突变体生产低聚龙胆糖的能力,发现了其中三株突变体G224A、G224V和G224N的转化率较野生型有所提高,转化率分别为17.01%、14.14%和15.45%,是野生型的1.7倍、1.35倍和1.48倍。对突变体G224A、G224N和G224V产生效果的原因进行分析,从结构上看甘氨酸A和缬氨酸V均为小侧链的疏水性氨基酸,增加了与+1位点葡萄糖残基的相互作用力,使得酶更容易发生转糖苷反应。突变体G224突变成天冬酰胺N后,其对龙胆二糖的β-1,6键型的选择性有所提高。进一步检测突变体的酶促反应动力学参数,发现三株优势突变体对龙胆二糖的K值相较于野生型明显下降,从野生型的3.68 mM下降到1.81 mM、2.39 mM和1.15 mM,这说明突变体对龙胆二糖的亲和力明显增加。此外,利用水/己醇的两相反应体系,测定酶的转苷/水解比,发现三株优势突变体的转苷/水解比率与野生型比有显著增加,这进一步说明了G224A、G224N和G224V三个优势突变体能够改变酶的转苷/水解比,提高酶的合成活性,最终使得低聚龙胆糖的转化率提高。(4)对优势突变体G224A进行摇瓶发酵优化和3-L发酵罐水平的高密度发酵的初步探索。突变体G224A在TB培养基中的发酵酶活为10.35 U·mL,摇瓶发酵的优化结果如下:当以15 g·L工业蛋白胨、5 g·L安琪玉米浆为组合氮源,以5 g·L葡萄糖为碳源,添加终浓度为1 mM的Ba离子时,摇瓶发酵24 h,酶活力最高可以达到16.32U·mL,之后在3-L发酵罐上进行了高密度发酵小试,依据摇瓶结果确定了发酵罐的初始培养基和补料培养基,扩大培养后的酶活可以达到297 U·mL,是未优化前的30倍,成功实现了突变体G224A重组菌的放大培养。

关键词： β-葡萄糖苷酶定点突变转苷/水解反应低聚龙胆糖发酵优化

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低聚龙胆糖的酶法生产技术

中国食品添加剂 2004年第3期15卷 97-101页

作者：邹辉黎锡流罗明姬华南理工大学食品与生物工程学院广州510640

本文介绍了一种以酶葡萄糖为原料生产低聚龙胆糖的技术。该技术采用了一种新型酶 ,这种新型酶的最适pH为 5 .0 ,最适温度为 70℃ ,若要保持 10 0 %酶活性 ,温度应控制在 5 5℃以下。该酶的等电点为 5 .30 ,分子量约为 85 0 0 0左右。

关键词：低聚龙胆糖酶法生产技术酶葡萄糖

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带苦味的低聚龙胆糖玉米糖浆

中国食品添加剂 2001年第2期12卷 52-54页

作者：黄琼华 NISSHOKU GENTOSE Nihon Shokuhin kako股份有限公司

低聚龙胆糖是以葡萄糖液为原料，经过专用酶的葡基转移作用和缩和作用生产出来的。由于低聚龙胆糖比蔗糖和麦芽糖浆（ｍａｌｔｓｙｒｕｐ）有较高的吸湿性（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｔｙ），因此可以保持各种食品中有合适的水分，从而防... 详细信息

低聚龙胆糖是以葡萄糖液为原料，经过专用酶的葡基转移作用和缩和作用生产出来的。由于低聚龙胆糖比蔗糖和麦芽糖浆（ｍａｌｔｓｙｒｕｐ）有较高的吸湿性（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｔｙ），因此可以保持各种食品中有合适的水分，从而防止淀粉质食品的老化。

关键词：低聚龙胆糖苦味糖浆食品吸湿性

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低聚龙胆糖的酶法生产技术

食品信息与技术 2004年第7期 50-50页

作者：邹辉

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件优化及固定化研究

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食品科学技术学报 2019年第3期37卷 41-47页

作者：汪飞吴敬陈晟江南大学食品科学与技术国家重点实验室/工业生物技术教育部重点实验室/教育部食品安全国际合作联合实验室

为了实现绿色木霉菌Trichoderma viride来源的β-葡萄糖苷酶在重组毕赤酵母中的高效表达,对重组菌***71/pPIC9K-bgl1/pPICZA-pdi进行3.6L罐发酵培养条件优化。结果表明,当诱导温度28℃,初始诱导菌体浓度50g/L,诱导阶段甲醇体积分数1.0%... 详细信息

为了实现绿色木霉菌Trichoderma viride来源的β-葡萄糖苷酶在重组毕赤酵母中的高效表达,对重组菌***71/pPIC9K-bgl1/pPICZA-pdi进行3.6L罐发酵培养条件优化。结果表明,当诱导温度28℃,初始诱导菌体浓度50g/L,诱导阶段甲醇体积分数1.0%时,酶活力最高,能达到1452U/mL。同时以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂,采用吸附交联法对β-葡萄糖苷酶进行固定化。结果表明,当壳聚糖质量浓度0.03g/mL,戊二醛质量浓度0.008g/mL,游离酶添加量400U/g(1g壳聚糖微球加酶量为400U),固定化吸附时间20h时,固定化酶酶活回收率最高,达到65.4%。以800g/L葡萄糖为底物,优化的转化条件下连续转化6次,低聚龙胆糖产率仍达到15.2%,显示出该固定化酶具有较好的持续利用性及较高的低聚龙胆糖生产能力。

关键词： β-葡萄糖苷酶毕赤酵母发酵优化固定化低聚龙胆糖

Thermotoga ***6来源GH1β-葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

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基因组学与应用生物学 2021年第5期40卷 2083-2090页

作者：盛玲玲夏伟吴敬吴丹江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学教育部食品安全国际合作联合实验室无锡214122

葡萄糖苷酶是利用葡萄糖制备低聚龙胆糖的关键用酶,而高转糖苷活性和高耐热性是适合于低聚龙胆糖酶法制备用β-葡萄糖苷酶的理想特性。研究表明,GH1家族的β-葡萄糖苷酶具备高转糖苷活性的优势。因此,本研究认为噬热菌来源的GH1耐热β-... 详细信息

葡萄糖苷酶是利用葡萄糖制备低聚龙胆糖的关键用酶,而高转糖苷活性和高耐热性是适合于低聚龙胆糖酶法制备用β-葡萄糖苷酶的理想特性。研究表明,GH1家族的β-葡萄糖苷酶具备高转糖苷活性的优势。因此,本研究认为噬热菌来源的GH1耐热β-葡萄糖苷酶是非常好的研究生产低聚龙胆糖的候选酶。为了满足β-葡萄糖苷酶的安全生产需要,本研究合成了热袍菌Thermotoga ***6来源的GH1家族的β-葡萄糖苷酶基因tsbgl,将其在Bacillus subtilis WS11中重组表达,并在摇瓶水平和3-L发酵罐水平上进行优化。结果表明,重组菌在TB培养基的基础上摇瓶发酵后的酶活可达到10.41 U/m L,之后在摇瓶水平上进行发酵优化,发现以15 g/L工业蛋白胨和5 g/L安琪玉米浆为组合氮源、5 g/L甘油为碳源、添加终浓度为1 mmol/L的Ba2+离子时,摇瓶发酵24 h,酶活力最高可以达到16.32 U/m L,是TB培养基摇瓶发酵酶活的1.56倍。依据摇瓶结果进行3-L发酵罐中的补料培养基的优化,确定葡萄糖为最优补料培养基,扩大培养后的酶活可以达到520 U/mL,是未优化前的49倍。本研究重组表达了耐热β-葡萄糖苷酶Tsbgl,并通过发酵优化有效提升了其在枯草芽孢杆菌中的发酵水平,为其食品级工业化生产及应用奠定了基础。

关键词： β-葡萄糖苷酶低聚龙胆糖发酵优化枯草芽孢杆菌

Talaromyces piceae来源β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及发酵优化

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基因组学与应用生物学 2021年第5期40卷 2091-2099页

作者：徐星豪夏伟吴敬江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学教育部食品安全国际合作联合实验室无锡214122

葡萄糖苷酶在利用高浓度葡萄糖生产低聚龙胆糖的工业应用中有很大潜力,但巨额的加酶量和菌株的蛋白表达能力一直是其工业化的瓶颈。实验室前期研究发现,蓝状菌Talaromyces piceae来源的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A能以较低加酶量高转化率制备... 详细信息

葡萄糖苷酶在利用高浓度葡萄糖生产低聚龙胆糖的工业应用中有很大潜力,但巨额的加酶量和菌株的蛋白表达能力一直是其工业化的瓶颈。实验室前期研究发现,蓝状菌Talaromyces piceae来源的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A能以较低加酶量高转化率制备低聚龙胆糖,但由于其在毕赤酵母中发酵水平尚不理想,使得加酶成本仍不能满足工业化生产的要求,发酵水平也有待进一步提高。本研究从初始诱导菌体浓度、温度及甲醇浓度3个方面开展了β-葡萄糖苷酶TpBgl3A在毕赤酵母重组工程菌Pichia pastoris KM71/p PIC9K-TpBgl3A的高密度发酵条件优化。实验结果显示,TpBgl3A重组菌的摇瓶表达酶活为240 U/mL,蛋白含量为0.51 g/L;在初始发酵条件下进行3.6 L罐高密度发酵,其酶活力最高为1058 U/m L,蛋白含量为2.75 g/L。条件优化结果表明,诱导温度25℃、初始诱导菌体OD600=150、甲醇浓度1.0%为该毕赤酵母重组菌最适发酵条件,最高发酵酶活高达2324 U/mL,蛋白含量达6.19 g/L,相比摇瓶表达分别提升了8.68倍和11.14倍,相比发酵优化前分别提高了1.20倍和1.25倍。可见,经条件优化,β-葡萄糖苷酶TpBgl3A高密度发酵水平显著提高,从而降低产酶成本,对于低聚龙胆糖酶法制备的工业化生产具有重要的潜在经济价值。

关键词： β-葡萄糖苷酶毕赤酵母高密度发酵发酵优化低聚龙胆糖