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硫化氢抑制低剪切应力诱导的内皮间质转化和动脉粥样硬化的机制研究

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硫化氢抑制低剪切应力诱导的内皮间质转化和动脉粥样硬化的机制研...

作者：周坤南华大学

学位级别：硕士

背景:低剪切应力诱导的内皮-间充质转化(Endothelial-mesenchymal transition,End MT)在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用,但其机制仍有待阐明。课题组的前期研究发现HS的外源性供体NaHS显著抑制低剪切应力诱导的ApoE小鼠As斑块形... 详细信息

背景:低剪切应力诱导的内皮-间充质转化(Endothelial-mesenchymal transition,End MT)在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用,但其机制仍有待阐明。课题组的前期研究发现HS的外源性供体NaHS显著抑制低剪切应力诱导的ApoE小鼠As斑块形成以及MEST表达,而且内皮细胞特异性过表达MEST可促进血管内皮细胞发生内皮间质转化进而加剧As病变。对MEST基因结构进行生物信息学分析发现,MEST基因上游存在锌指转录因子NFIL3特异性的识别和结合位点,同时NFIL3的60、175、208位氨基酸为半胱氨酸残基,为HS的潜在巯基化修饰位点。HS能否巯基化修饰这些位点?对这位点的修饰是否影响MEST的表达和End MT以及As发生发展?这些问题值得深入探讨。目的:从HS对NFIL3的巯基化修饰及对MEST表达的调控探索其在低剪切应力诱导的End MT和As中的作用。方法:1.ApoE小鼠分为对照组和NaHS组,NaHS组小鼠经腹腔注射NaHS(HS外源性供体,剂量为56μmol/kg/d),对照组则经腹腔注射等体积的PBS;两组均进行左颈总动脉局部结扎手术,结扎其颈内动脉、颈外动脉和枕动脉,高脂饮食喂养2周,安乐处死并取其颈动脉,采用H&E和油红O染色检测颈动脉中As病变;免疫荧光检测颈动脉中MEST表达水平;2.高脂饮食喂养的ApoE小鼠分为对照组和内皮细胞特异性敲低MEST组(记为AAV-MEST-RNAi组),喂养16周时安乐处死并取材,采用免疫荧光检测小鼠主动脉MEST的蛋白表达水平;全自动生化分析仪检测小鼠血脂水平;体视显微镜观察、油红O染色检测小鼠主动脉的As斑块;H&E、油红O和Masson染色检测主动脉根部As斑块病理形态;免疫荧光观察主动脉根部斑块区域α-SMA、Vimentin、CD31、VE-Cadherin蛋白表达;3.HUVECs分两种处理形式:剪切应力处理(15dyn/cm(生理层流剪切应力)组和2dyn/cm(低剪切应力组))和低剪切应力+GYY4137(HS供体缓释剂,200mmol/L预处理HUVECs24h)处理(2dyn/cm组和2dyn/cm+GYY4137组),采用Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、N-Cadherin、α-SMA、CD31和VE-Cadherin蛋白表达,生物素开关法检测NFIL3的巯基化水平,CHIP-q PCR检测NFIL3与MEST DNA结合水平;4.HUVECs分别转染LV-MEST-RNAi和LV-NFIL3-RNAi后进行低剪切应力处理:分为NC+2dyn/cm组、LV-MEST-RNAi+2dyn/cm组和LV-NFIL3-RNAi+2dyn/cm组,Western blotting检测细胞NFIL3、MEST、v WF、CD31、FAP、Vimentin、α-SMA、N-Cadherin和Tie2蛋白表达;5.GYY4137(0、100、200、400mmol/L)预处理HUVECs24h后进行低剪切应力处理,免疫荧光检测NFIL3的核转位情况;6.双荧光素酶报告基因检测NFIL3三个半胱氨酸分别突变为丝氨酸后MEST DNA的启动子活性,以及生物素开关法检测NFIL3突变前后的巯基化水平。结果:1.对照组小鼠的左颈总动脉与右颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显增多,MEST表达增多;NaHS组小鼠的左颈总动脉与对照组小鼠的左颈总动脉相比,油红O红染的斑块明显减少,MEST表达减少;2.与Control组相比,AAV-MEST-RNAi组MEST蛋白表达减少了61.42%(P低效果最好的一组进行下一步实验;与NC+2dyn/cm组相比,LV-MEST-RNAi+2dyn/cm组的CD31、v WF和Tie2蛋白表达

关键词：硫化氢 NFIL3 中胚叶特异性转录子低剪切应力内皮间质转化动脉粥样硬化

苦瓜蛋白对低剪切应力下apoE^(−/−)小鼠内皮-间充质转化的影响

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中国病理生理杂志 2021年第3期37卷 443-449页

作者：张凯刘峰涛刘亚密陶军夏林珍梁伶俐王佐南华大学附属第二医院重症监护室湖南衡阳421001 南华大学心血管疾病研究所湖南衡阳421001

目的:探讨苦瓜蛋白对低剪切应力内皮-间充质转化的影响,探讨其抗动脉粥样硬化作用新机制。方法:构建apoE^(−/−)小鼠颈动脉低剪切应力模型,将20只apoE^(−/−)小鼠随机分为苦瓜蛋白组和模型组,均予以高脂饮食喂养,苦瓜蛋白组腹腔注射苦瓜蛋... 详细信息

目的:探讨苦瓜蛋白对低剪切应力内皮-间充质转化的影响,探讨其抗动脉粥样硬化作用新机制。方法:构建apoE^(−/−)小鼠颈动脉低剪切应力模型,将20只apoE^(−/−)小鼠随机分为苦瓜蛋白组和模型组,均予以高脂饮食喂养,苦瓜蛋白组腹腔注射苦瓜蛋白(5 mg·kg^(−1)·d^(−1)),模型组注射等体积的生理盐水。ELISA检测apoE^(−/−)小鼠血浆中炎症因子水平;Western blot和免疫荧光检测颈总动脉中内皮及间充质标志物表达和共定位情况,以及细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达水平。结果:模型组低剪切应力下内皮完整性受损,且出现了动脉粥样硬化病变和内皮-间充质转化,但均可被苦瓜蛋白可所抑制。与模型组比较,苦瓜蛋白组内皮标志物血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)表达显著上调(P低血清炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及IL-1β水平,以及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达水平。结论:苦瓜蛋白能减轻低剪切应力下内皮-间充质转化,与其抑制炎症因子和黏附分子的表达有关。

关键词：苦瓜蛋白动脉粥样硬化低剪切应力内皮-间充质转化炎症

低剪切应力对血管内皮细胞自噬的影响及其机制的初步研究

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低剪切应力对血管内皮细胞自噬的影响及其机制的初步研究

作者：李小红南华大学

学位级别：硕士

[目的]观察低剪切应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的影响并探讨其机制。[方法](1)apo E-/-小鼠喂饲高脂饮食,分别于0、4、8和12周处死,取主动脉窦部做冰冻切片,主动脉提蛋白。HE和油红O染色法观察动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)... 详细信息

[目的]观察低剪切应力对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的影响并探讨其机制。[方法](1)apo E-/-小鼠喂饲高脂饮食,分别于0、4、8和12周处死,取主动脉窦部做冰冻切片,主动脉提蛋白。HE和油红O染色法观察动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)斑块病变;免疫组织化学法和Western blot检测BECLIN 1、LC3和P62以及TET2的蛋白表达;免疫荧光法观察5-m C和5-hm C的含量。(2)将HUVECs置于体外灌流系统,分别以低剪切应力(5 dyne/cm2)和正常剪切应力(15 dyne/cm2)处理1h,Western blot检测BECLIN 1、LC3和P62以及TET2的蛋白表达。再以巴伐洛霉素孵育2h,观察LC3II/LC3I的比值。(3)低表达和高表达TET2质粒转染HUVECs,Western blot检测BECLIN 1、LC3和P62的蛋白表达。再以不同剪切应力处理1h,Western blot检测BECLIN 1、LC3、P62和ET-1及e NOS的蛋白表达。[结果]随着高脂饮食时间的延长,As病变程度逐渐加重。As病变进程中BECLIN 1、LC3和P62的蛋白含量显著增加;TET2的蛋白表达明显降低;5-m C的含量显著增加,且其增加幅度显著高于5-hm C。与正常剪切应力组相比,低剪切应力组BECLIN 1和LC3II/LC3I的蛋白表达降低;自噬障碍标志物P62的蛋白表达增加;TET2的蛋白表达降低。巴伐洛霉素孵育2h后,低剪切应力组LC3II/LC3I无明显变化,而正常剪切应力组LC3II/LC3I明显增大。不同剪切应力处理后,高表达TET2可以上调BECLIN 1、LC3II/LC3I及e NOS的蛋白表达,下调P62及ET-1的蛋白表达;而低表达TET2可以下调BECLIN1、LC3II/LC3I及e NOS的蛋白表达,上调P62及ET-1的蛋白表达。[结论]低剪切应力下调血管内皮细胞TET2的蛋白表达从而抑制血管内皮细胞自噬。

关键词：低剪切应力血管内皮细胞自噬 TET2 动脉粥样硬化

低剪切应力对小鼠腹主动脉重建的影响及其作用机制的研究

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低剪切应力对小鼠腹主动脉重建的影响及其作用机制的研究

作者：刘莹南方医科大学

学位级别：硕士

背景和目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)导致的心脑血管疾病是危害人类健康的主要原因之一,AS的致病机理一直是心血管领域的研究热点,粥样斑块常出现于动脉特定部位(血流低速区,回流区等),最主要的脂质浸润学说、血栓形成学说、... 详细信息

背景和目的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)导致的心脑血管疾病是危害人类健康的主要原因之一,AS的致病机理一直是心血管领域的研究热点,粥样斑块常出现于动脉特定部位(血流低速区,回流区等),最主要的脂质浸润学说、血栓形成学说、单克隆学说和损伤反应学说等并不能完全解释AS发生的局灶性(localization of atherosclerosis),而血流动力学因素在AS发生条件中具有主要的作用,血流动力学成因理论为认识AS的局灶性和发病机制提供了新的视角,与作用时间相关的血流剪切应力,尤其是低剪切应力(low shear stress)大小、方向的改变,可通过引起血管重建(vascular remodeling)和内皮黏附分子(endothelial adhesion molecule)表达的上调,导致内皮炎症的发生,从而在AS的发生、发展中起着关键作用。正常范围的血流剪切应力对于维持血管稳态包括抗血栓形成、屏障功能和血管本身的动态平衡有重要的调节作用,血流剪切应力改变后血管稳定性受到破坏,将致使血管重建的发生。血管重建是指为适应内、外环境(尤其是力学环境)的变化而发生的血管形态结构和功能的一系列适应性改变,包括早期组分不变的适应性重排和晚期结构与功能改变的病理性重建,而病理性的血管重建是动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等常见心脑血管病变共同的病理基础,但是造成血管重建的细胞分子生物学机制尚不清楚。剪切力学说认为,均匀的层流剪切力可选择性地诱导内皮抗动脉粥样硬化基因的表达,作用于局部以抵消全身危险因素的有害作用,当剪切力的性质和大小出现异常,内皮分泌抗动脉粥样硬化分子减少,促炎因子表达增加,从而激活相应的信号转导通路,参与诱导炎症进展,导致血管重建和AS的发生、发展。炎症细胞与内皮细胞的粘附和跨壁转移是AS形成机制的第一步,正常情况下白细胞很难与内皮黏附,只有当外来因素如细胞因子、氧化脂蛋白、切应力等与内皮相互作用后使内皮表面不表达或低表达的粘附分子如：细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)、VCAM-1、P-选择素和E-选择素等表达增加,有助于各种白细胞的粘附。其中P-选择素(P-selectin)在动脉病变早期对活化的血小板、白细胞与内皮细胞的初次黏附起决定性作用,是启动内皮炎症反应并维持炎症状态的关键成分,正常的内皮细胞仅表达极少量无介导白细胞活性的P-选择素,在血流低切应力等因素持续作用下,通过进一步的脂质堆积、内皮功能改变等引起炎症刺激内皮,内皮才表达具有介导炎症细胞活性的P-选择素;而血管内皮黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)主要在后续的白细胞与内皮细胞的紧密黏附及介导白细胞渗出、迁移过程中起作用,正常条件下内皮不表达VCAM-1,理化因素(如血流剪切应力异常等)刺激损伤内皮后表达增加,并有延迟表达或持续长久的特点,可促进对内皮的损伤,亦是维持内皮炎症状态的关键成分之一。因此,如果血流剪切应力异常是AS发生的始动因素,内皮表达的P-选择素、VCAM-1等粘附分子则可能是AS形成的枢纽之一。如能尽早检测出反映血流动力学变化的综合指标,深入研究剪切力变化早期引起的血管生物学效应以及其与AS形成之间的关系和作用机制,对进一步揭示AS的本质、探索防治AS的方法有重要的理论和实际意义。目前已有研究发现,大小、形态异常的血流剪切应力作用可通过影响多种炎症分子的表达而导致不同性质的粥样斑块形成,但有关血流动力学变化早期,低剪切应力作用对动脉病变早期血管重建的影响及其相关分子生物学机制尚不清楚。为此,本研究拟通过制备小鼠腹主动脉局部狭窄模型,在同一段平直血管上建立近似层流和振荡流的低剪切应力区域,观察血流动力学改变短时间内不同形态低剪切应力对动脉重建和内皮P-选择素表达的影响,并在此基础上较长时间观察近似层流低剪切应力作用下动脉病理形态学与内皮P-选择素、VCAM-1等黏附分子表达的动态变化,以进一步了解低剪切应力引起的血管生物学效应与早期AS发生、发展之间的关系及其作用机制。材料和方法1、实验动物分组：①短时间观察组：20只昆明小白鼠,性别不限,体重(18.0-2.0)g,随机分为短时间对照组和短时间观察组(狭窄1h,4h,24h组),每组5只;②长时间观察组：25只昆明小白鼠,性别不限,体重(18.0-2.0)g,随机分为长时间对照组和长时间观察组(狭窄1d,7d,14d,28d组),每组5只。2、腹主动脉局部狭窄模型制备：狭窄组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,仰卧位固定四肢,腹部去毛后75%酒精消毒皮肤,取正中线剪开皮肤及腹壁,移开肠腔并用温盐水纱布保湿,分离左肾动脉分支与髂动脉分叉之间腹主动脉,平直段放置内径0.1mm动脉银夹,小心回置肠腔,无菌缝合切口关闭腹腔,对照组组小鼠

关键词：低剪切应力血管重建 P-选择素 VCAM-1 动脉粥样硬化

烟酸姜黄素酯对低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制

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中国临床药理学与治疗学 2018年第8期23卷 855-861页

作者：刘静王媚媚刘录山贺卫和庹勤慧文红艳湖南中医药大学中西医结合学院南华大学附属南华医院儿科南华大学心血管研究所湖南中医药大学医学院

目的:探讨烟酸姜黄素酯(curcumin nicotinate,CN)对低剪切应力(low shear stress,LSS)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡的影响及机制研究。方法:运用平行平板流动腔建立LSS诱导的HUVECs凋亡模型。采用Hoechst33258荧光染色,流式细胞术检测CN对LSS诱导的HUVECs凋亡的影响。Western blot检测CN对LSS诱导的HUVECs中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白表达的影响。结果:Hoechst33258荧光染色结果显示,与静态培养组比较,LSS组(3 dyne/cm2,12 h)内呈现凋亡状态的HUVECs明显增多。与LSS组比较,各CN+LSS组内呈现凋亡状态的HUVECs明显减少,并且呈现浓度依赖性。其中以20μmol/L CN+LSS组凋亡细胞数最少;流式细胞术结果显示,与静态培养组比较,LSS组HUVECs凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.01);与LSS组比较,各CN+LSS组HUVECs凋亡率明显减少,并且呈现浓度依赖性,其中以20μmol/L CN+LSS组HUVECs凋亡率减少最为明显,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示与静态培养组比较,LSS组内PCSK9蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与LSS组比较,CN+LSS组内PCSK9蛋白表达下降,并且呈现浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中以20μmol/L CN+LSS组PCSK9蛋白表达下降最为明显(P<0.01)。结论:CN能够抑制LSS诱导的HUVECs凋亡,其作用机制与CN下调LSS处理的HUVECs中PCSK9蛋白表达相关。

关键词：动脉粥样硬化烟酸姜黄素酯低剪切应力人脐静脉内皮细胞细胞凋亡前蛋白转化酶枯草溶菌素9

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低剪切应力与动脉粥样硬化形成研究新进展

中国动脉硬化杂志 2019年第5期27卷 432-438页

作者：谭利兰罗勇肖晨张韶泽危当恒王春燕南华大学心血管疾病研究所动脉硬化学湖南省重点实验室湖南省衡阳市421001 南华大学附属第二医院重症医学科湖南省衡阳市421001

动脉粥样硬化病变为动脉内膜损伤诱导性增生,好发于动脉的分叉和分支等低剪切应力(LSS)区域。LSS通过激活细胞上的膜感受器和细胞内信号转导而调节基因表达以及表型的转变,在动脉粥样硬化病变的发生和发展中起着重要作用。本文综述了LS... 详细信息

动脉粥样硬化病变为动脉内膜损伤诱导性增生,好发于动脉的分叉和分支等低剪切应力(LSS)区域。LSS通过激活细胞上的膜感受器和细胞内信号转导而调节基因表达以及表型的转变,在动脉粥样硬化病变的发生和发展中起着重要作用。本文综述了LSS与内皮细胞炎症、内皮间质转化、内皮细胞自噬间的关系及其调控机制,期望为动脉粥样硬化防治提供新的思路和策略。

关键词：低剪切应力动脉粥样硬化内皮间质转化自噬

TET2/SDHB在低剪切应力诱导HUVECs焦亡中的作用及其机制研究

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TET2/SDHB在低剪切应力诱导HUVECs焦亡中的作用及其机制研究

作者：陈金娜南华大学

学位级别：硕士

[背景]低剪切应力诱导的血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）炎症在动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）的发生发展过程中起着重要作用,但其调节机制尚不清楚。新近研究表明,细胞焦亡是一种炎性、程序性的细胞死亡形式,与A... 详细信息

[背景]低剪切应力诱导的血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）炎症在动脉粥样硬化（atherosclerosis,As）的发生发展过程中起着重要作用,但其调节机制尚不清楚。新近研究表明,细胞焦亡是一种炎性、程序性的细胞死亡形式,与As的发生和发展密切相关。我们前期的研究表明,Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2（Tet methylcytidine dioxygenase 2,TET2）是剪切应力敏感基因,低剪切应力下调TET2的表达,TET2 shRNA上调血管内皮细胞琥珀酸脱氢酶复合体B亚基（Succinic acid dehydrogenase complex B,SDHB）的表达。在本文中,我们将探讨TET2/SDHB在低剪切应力诱导VECs焦亡中的作用及其机制。[目的]探讨低剪切应力诱导VECs焦亡的调节机制。[方法]1、采用平行平板流动腔系统,从细胞水平观察低剪切应力和生理剪切应力下人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β以及TET2和SDHB的表达;2、采用慢病毒转染技术构建四种HUVECs即TET2低表达HUVECs、TET2高表达HUVECs、SDHB高表达HUVECs和SDHB低表达HUVECs,荧光显微镜和Western blot技术检测其转染效率;3、Western blot检测TET2 shRNA和SDHB过表达对焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18和IL-1β表达的影响;4、采用Western blot检测TET2 shRNA和TET2过表达后的SDHB蛋白表达水平,并使用琥珀酸脱氢酶试剂盒检测TET2 shRNA和过表达TET2下的SDH的活性;5、Western blot检测过表达TET2和SDHB shRNA在低剪切应力下VECs焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18和IL-1β的表达;6、透射电镜、流式细胞技术、ATP含量测定试剂盒、活性氧荧光探针检测SDHB过表达对HUVECs线粒体形态和功能的影响;7、过表达SDHB后加入活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-cysteine,NAC）并使用活性氧荧光探针检测VECs线粒体ROS水平的影响,Western blot检测NAC对过表达SDHB诱导的焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18和IL-1β表达的影响;8、采用Western blot检测组蛋白去乙酰化酶2（Histone deacetylase2,HDAC2）抑制剂（MS-275）对血管内皮细胞HDAC2蛋白表达的影响,Western blot检测MS-275对过表达TET2的HUVECs SDHB表达的影响,ROS荧光探针技术检测线粒体ROS的水平并采用Western blot检测VECs焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18和IL-1β的影响。[结果]低剪切应力上调VECs焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18、IL-1β以及SDHB的表达,下调TET2的表达。荧光显微镜和Western blot结果表明成功构建TET2低表达、TET2高表达、SDHB低表达以及SDHB高表达的HUVECs。TET2 shRNA上调VECs焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18以及IL-1β表达水平;低剪切应力条件下,过表达TET2明显抑制低剪切应力下VECs焦亡相关蛋白水平。TET2 shRNA上调SDHB的表达,增加了SDH的活性;过表达TET2下调了SDHB的表达,降低了SDH的活性。SDHB过表达上调焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18以及IL-1β的表达;SDHB shRNA抑制低剪切应力诱导的HUVECs焦亡相关蛋白的表达。透射电镜结果表明SDHB过表达组线粒体嵴缩短并移向周围、线粒体的体积增大、数量减少且出现局灶性空泡;流式细胞术显示SDHB过表达组HUVECs大部分细胞分布在Q3区,同时Q2/Q3的比例减少,线粒体膜电位异常;ATP含量测定结果表明SDHB过表达对VECs线粒体ATP生成无明显影响;ROS荧光探针检测结果表明SDHB过表达组其ROS水平明显高于对照组。ROS清除剂NAC减少SDHB过表达所诱导的ROS增加;NAC下调SDHB过表达诱导的焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18以及IL-1β的表达。MS-275明显抑制血管内皮细胞HDAC2的表达,但TET2过表达对HDAC2蛋白的表达无明显影响。与

关键词：低剪切应力 TET2 SDHB 线粒体功能障碍焦亡

TET2在低剪切应力诱导HUVECs焦亡中的作用及其机制研究

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TET2在低剪切应力诱导HUVECs焦亡中的作用及其机制研究

作者：彭文夕南华大学

学位级别：硕士

低剪切应力诱导血管内皮细胞(Vascular endothelial cells,VECs)炎症是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的重要环节,但其具体调控机制尚不明确。新近研究提示,焦亡(炎性程序性细胞死亡)是剪切应力敏感的生物学过程并贯穿As病变进程。... 详细信息

低剪切应力诱导血管内皮细胞(Vascular endothelial cells,VECs)炎症是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的重要环节,但其具体调控机制尚不明确。新近研究提示,焦亡(炎性程序性细胞死亡)是剪切应力敏感的生物学过程并贯穿As病变进程。前期研究表明DNA羟甲基化酶TET2为剪切应力敏感基因,低剪切应力负性调控TET2的表达,但低剪切应力与As间的关系以及TET2在低剪切应力诱导As中的作用及其调控机制尚不清楚。目的:探讨TET2在低剪切应力诱导HUVECs焦亡中的作用及其机制。方法:1、采用平行平板流动腔系统,细胞水平观察低剪切应力和生理剪切应力下人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)焦亡相关蛋白Caspase1、GSDMD、NLRP3、IL-1β以及TET2的表达水平;2、采用慢病毒转染技术,构建低表达TET2 HUVECs细胞株,免疫荧光和Western blotting检测其转染效率;3、免疫荧光检测TET2 shRNA对细胞焦亡相关蛋白Caspase1的表达水平;Western blot检测TET2 shRNA对HUVECs焦亡相关蛋白Caspase1、GSDMD、NLRP3、AIM、IL-1β的表达水平;透射电镜观察TET2 shRNA对HUVECs焦亡的影响;4、透射电镜、流式细胞术、ATP含量测定试剂盒、ROS荧光探针检测TET2 shRNA对HUVECs线粒体形态和功能的影响。结果:Western blot结果表明,与生理剪切应力相比,低剪切应力组HUVECs焦亡相关蛋白Caspase1、GSDMD、NLRP3、IL-1β表达明显上调;Western blot结果表明,与生理剪切应力相比,低剪切应力明显下调TET2的表达水平;免疫荧光结果表明TET2慢病毒转染效率高达90%,Western blotting结果表明TET2shRNA明显下调TET2表达;免疫荧光显示TET2 shRNA组Caspase1表达明显高于对照组;Western blot结果表明TET2 shRNA明显上调HUVECs焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase1、GSDMD、IL-1β表达,但对AIM的表达无明显影响;透射电镜结果表明TET2 shRNA处理组细胞膜破裂,胞内容物外泄;透射电镜结果表明TET2 shRNA组线粒体体积增大,线粒体嵴移向周围、缩短、数量变少,并出现局灶性空泡,表明TET2 shRNA组诱导HUVECs线粒体损伤;流式细胞术结果显示TET2 shRNA组HUVECs线粒体膜电位异常,主要表现为:大部分细胞分布在Q3区,同时Q2/Q3的比例减少;ATP含量测定结果表明TET2 shRNA组HUVECs线粒体ATP生成明显低于对照组;ROS生成水平测定结果表明TET2 shRNA组明显高于对照组。结论:低剪切应力下调TET2,导致线粒体功能障碍,促使HUVECs焦亡。

关键词： TET2 低剪切应力焦亡线粒体动脉粥样硬化

TET2抑制低剪切应力诱导的动脉粥样硬化及其机制研究

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TET2抑制低剪切应力诱导的动脉粥样硬化及其机制研究

作者：李阿芳南华大学

学位级别：硕士

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生发展表现为动脉对内膜损伤导致的纤维增生性反应,低剪切应力诱导内皮间质转化(End MT)且为As进程中重要的生物学过程,但其调控机制尚不清楚。研究表明DNA羟甲基化酶TET2为剪切应力敏感基因,TET2... 详细信息

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生发展表现为动脉对内膜损伤导致的纤维增生性反应,低剪切应力诱导内皮间质转化(End MT)且为As进程中重要的生物学过程,但其调控机制尚不清楚。研究表明DNA羟甲基化酶TET2为剪切应力敏感基因,TET2缺失或突变促进As进程。目的:本文将探讨TET2对低剪切应力下End MT的影响。方法:1、采用颈总动脉局部结扎apo E-/-小鼠模型,动物实验分组如下:(1)颈总动脉局部结扎;(2)颈总动脉局部结扎+TET2过表达慢病毒载体(LV-TET2)感染组;2、采用人重组TGFβ1诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEs)发生End MT,使用TET2过表达慢病毒载体(LV-TET2)、TET2干扰慢病毒载体(TET2 sh RNA)转染技术,从细胞分子水平检测TET2对End MT的影响,分组如下:(1)空白对照组,(2)TGFβ1处理组,50ng/ml,(3)TET2 sh RNA转染组,(3)LV-TET2转染+TGFβ1处理组。结果:动物实验,HE、油红O染色结果显示,对照组apo E-/-小鼠As病变严重,TET2过表达明显抑制局部狭窄apo E-/-小鼠As病变;免疫荧光显示TET2过表达组血管内皮细胞VE-Cadherin,CD31表达高于对照组,间质细胞抗原(如α–SMA)以及Wnt/β–catenin信号通路下游靶基因MYC、ID1、AXIN2低于对照组。细胞学实验结果表明,与对照组相比,经TGFβ1处理后的HUVEs形态及细胞骨架发生改变,VE-Cadherin蛋白表达减少,而α-SMA、FAP等间质标记蛋白表达上调;与对照组相比,TET2干扰组中VE-Cadherin蛋白质表达减少,而α-SMA蛋白质表达量增多,FAP蛋白质表达量无明显改变;而与TGFβ1处理组相比,LV-TET2+TGFβ1组细胞形态保持鹅卵石形,细胞骨架无明显变化,VE-Cadherin蛋白表达上调、α-SMA、FAP等蛋白表达下调。结论:TET2通过下调Wnt/β-catenin信号途径抑制低剪切应力诱导的内皮间质转化,抑制As。

关键词： TET2 Wnt/β-catenin 低剪切应力内皮间质转化动脉粥样硬化