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伴侣素纳米筒分散稳定的Pickering乳液性能研究及其应用探索

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伴侣素纳米筒分散稳定的Pickering乳液性能研究及其应用探索

作者：徐宝美中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

通过生物来源的颗粒稳定Pickering乳液在食品、化妆品或生物医学制剂中显示出巨大潜力,因为它们具有优异的生物相容性、生物降解性以及功能性。生物来源的颗粒尤其是蛋白质纳米粒子令人特别感兴趣,其天然的两亲性质和营养价值在制备高级... 详细信息

通过生物来源的颗粒稳定Pickering乳液在食品、化妆品或生物医学制剂中显示出巨大潜力,因为它们具有优异的生物相容性、生物降解性以及功能性。生物来源的颗粒尤其是蛋白质纳米粒子令人特别感兴趣,其天然的两亲性质和营养价值在制备高级Pickering乳液方面具有双重益处。虽然最常见的蛋白质纳米粒子在水溶液中显示出优异的单分散性,但它们很容易受到工业乳液的过程变量的影响(例如,高温或宽p H变化)。此外,蛋白质表面通常呈现高度异质性,其电荷和疏水性的不规则分布会导致界面处蛋白质取向的不确定性或降低蛋白表面活性。故常需表面改性或甚至加热变性以进一步改善蛋白质在分散相液滴周围的堆积以提高其乳化能力。然而,这在很大程度上难以精准控制,并且在配制蛋白质分散的乳液方面增加了额外的复杂性。因此,非常希望开发固有精致结构和高表面活性的蛋白质纳米颗粒,以有效稳定高级Pickering乳液。在本论文中,伴侣素GroEL纳米筒状蛋白及其单环突变体SR,被引入作为新的Pickering乳化剂。一方面它们具有良好的热稳定性和化学稳定性,另一方面其顶端疏水腔有助于油相的有效分散。本论文主要对GroEL及SR稳定的Pickering乳液的组成、稳定性进行了研究,并探索了在配制功能性食品中的潜在应用。主要包括以下几个方面的内容:首先,表达纯化了目的蛋白GroEL及SR。通过SDS-PAGE、质谱、透射电子显微镜和动态光散射对目的蛋白的分子量、结构完整性、形貌和单分散性等进行了系统表征。此外,采用绿色荧光染料Alexa Fluor 488(AF488)对GroEL及SR进行了荧光标记,为Pickering乳液研究奠定基础。其次,以伴侣素GroEL为乳化剂制备了Pickering乳液。采用光学显微镜和荧光显微镜表征了Pickering乳液的微观结构,并对配方进行了优化。结果表明油水比例为0.05-0.35(v/v)、蛋白质量分数在0.05-0.45(wt.%)之间乳液稳定性较好,此时液滴的大小在200-450 nm左右。Pickering乳液Zeta电位研究表明,GroEL表面电荷发挥着重要作用。同时,在中性至碱性p H值、离子强度高达200 m M、存储温度至65℃时,Pickering乳液表现出良好的稳定性。流体力学研究表明,乳液呈非牛顿流体性质,油水比超过0.30(v/v)时,会形成高级的凝胶网络结构。β-胡萝卜素的包埋和稳定研究表明,氧化剂、紫外线辐射、还原剂和蔗糖对包裹在GroEL稳定的Pickering乳液中的β-胡萝卜素的稳定性影响依次减弱。此外,温度、离子强度和p H等通过影响乳液稳定性进而对包载的β-胡萝卜素稳定性产生影响。最后,对比研究了GroEL的单环突变体SR对Pickering乳液的稳定性能。研究表明SR对Pickering乳液稳定效果和稳定条件与GroEL大体相同。但是,相比而言SR稳定的乳液离子强度耐受能力比GroEL强,而GroEL稳定的乳液的温度耐受能力比SR强。对于β-胡萝卜素的包埋和稳定研究表明,SR和GroEL效果基本一致。

关键词：伴侣素单环突变体 Pickering乳液稳定 β-胡萝卜素

牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCT_η基因的克隆与生物信息学分析

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畜牧与兽医 2012年第10期44卷 17-19页

作者：黄国明薛书江贾立军李闯张守发延边大学农学院动物医学系吉林延吉133002

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码... 详细信息

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。

关键词：牛卵形巴贝斯虫伴侣素 CCTη基因生物学信息

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真核细胞伴侣素CCT及其与细胞骨架的关系

中国细胞生物学学报 2011年第7期33卷 822-825页

作者：段芳蕾孙兴旺曹灵泸州医学院病理学教研室泸州646000 泸州医学院附属医院肾病内科泸州646000

CCT(the chaperonin containing tailless complex polypeptide 1)是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白,也是迄今为止真核细胞胞浆中发现的唯一伴侣素。目前认为大约15%的哺乳动物蛋白折叠需要CCT的参与,其中研究得最多的是肌动蛋... 详细信息

CCT(the chaperonin containing tailless complex polypeptide 1)是一种广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白,也是迄今为止真核细胞胞浆中发现的唯一伴侣素。目前认为大约15%的哺乳动物蛋白折叠需要CCT的参与,其中研究得最多的是肌动蛋白和微管蛋白。研究发现,CCT的异常会导致细胞骨架蛋白发生改变,甚至影响细胞骨架的形成与解聚。由此推测,一些细胞骨架相关疾病可能与CCT异常有关。

关键词：伴侣素 CCT 细胞骨架肌动蛋白微管蛋白

伴侣素CCT的结构及与肌动蛋白、微管蛋白的作用机制

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国外医学（生理病理科学与临床分册） 2003年第6期23卷 596-598页

作者：常晓燕陈杰中国协和医科大学、中国医学科学院、北京协和医院病理科，北京100730

CCT是所有真核生物胞浆内共存的唯一一个伴侣素 (chaperonin) ,具有复杂的结构 ,与I型伴侣素有着不同的作用机制。CCT主动参与肌动蛋白和微管蛋白的折叠和组装。

关键词：分子伴侣伴侣素 CCT 肌动蛋白微管蛋白

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早孕因子的研究进展

中国生物制品学杂志 2010年第12期23卷 1392-1396页

作者：吴晓亮练玉银王家骥广州医学院公共卫生与全科医学学院广州510182

早孕因子(Early pregnancy factor,EPF)是一种具有免疫抑制和生长因子特性的分泌性蛋白质,在受精后的孕血清及某些恶性肿瘤患者血清中均能检测到。EPF与伴侣素10(Chaperonin 10,Cpn10)是同源的。EPF首先通过玫瑰花结抑制试验在哺乳动物... 详细信息

早孕因子(Early pregnancy factor,EPF)是一种具有免疫抑制和生长因子特性的分泌性蛋白质,在受精后的孕血清及某些恶性肿瘤患者血清中均能检测到。EPF与伴侣素10(Chaperonin 10,Cpn10)是同源的。EPF首先通过玫瑰花结抑制试验在哺乳动物的孕血清中被发现。EPF单克隆抗体在妊娠诊断、肿瘤诊断和治疗等方面均有广阔的应用潜力。本文就EPF的来源、化学结构和生化特性、分离纯化及检测、作用及应用等研究进展作一综述。

关键词：早孕因子玫瑰花结抑制试验伴侣素

介导新生肽链折叠的胞质分子伴侣结构、功能及作用机制研究进展

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生物物理学报 2014年第3期30卷 169-181页

作者：于志超李艳妮乔建军天津大学化工学院天津300072 教育部系统生物工程重点实验室天津300072

分子伴侣是一类能够识别非天然蛋白并能协助其正确折叠、组装和转运的功能蛋白。最新研究发现,在原核或真核细胞中,不同结构、不同种类的分子伴侣形成了一个复杂的折叠系统,通过这个系统,蛋白质完成了从初步合成到形成具有生物活性的三... 详细信息

分子伴侣是一类能够识别非天然蛋白并能协助其正确折叠、组装和转运的功能蛋白。最新研究发现,在原核或真核细胞中,不同结构、不同种类的分子伴侣形成了一个复杂的折叠系统,通过这个系统,蛋白质完成了从初步合成到形成具有生物活性的三维构象的过程,避免了折叠过程中多肽链的错误折叠、蛋白沉淀和有害物质的产生。文章综述了蛋白质折叠过程中不同种类分子伴侣组件的结构、功能和作用机制的研究进展,这些分子伴侣包括Hsp70、核糖体结合因子、伴侣素、前折叠素与Hsp90,并阐述了它们在蛋白质内稳态中的作用。

关键词：分子伴侣 Hsp70 伴侣素 Hsp90 蛋白质内稳态

叶绿素在桶状蛋白纳米笼中超分子组装及光催化性质研究

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叶绿素在桶状蛋白纳米笼中超分子组装及光催化性质研究

作者：潘美红中国石油大学(华东)

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叶绿素是自然界存在的天然光催化剂,当其与生物环境分离时,在光照射下容易光降解,导致它在光照相关领域中的应用受限。光稳定性的提高是构建人工光催化剂需要解决的关键问题。从仿生催化的角度考虑,将叶绿素引入与天然结构类似的水溶性... 详细信息

叶绿素是自然界存在的天然光催化剂,当其与生物环境分离时,在光照射下容易光降解,导致它在光照相关领域中的应用受限。光稳定性的提高是构建人工光催化剂需要解决的关键问题。从仿生催化的角度考虑,将叶绿素引入与天然结构类似的水溶性蛋白中,利用其精致的结构和特殊的微环境可能会更好地调控叶绿素的光催化性能。本论文选用由两个环背对背构成的纳米桶状GroEL及其突变体单环SR1为目标蛋白,选取叶绿素a及其衍生物作为光催化剂模型。研究中秉持仿生催化的理念并依托超分子化学的特点,利用透析的方法将叶绿素a及其衍生物引入伴侣素GroEL及SR1的疏水空腔,以构建色素-蛋白复合物形式的光催化剂,并对其制备过程及性质进行了探究。主要内容如下:1)将叶绿素a通过透析的方法引入到GroEL的疏水空腔,制备Chl a@GroEL复合体。研究表明,GroEL可以有效稳定疏水叶绿素a;Chl a@GroEL复合体可实现对甲基紫精的光还原;比例为1:40的Chl a@GroEL复合体用于制备太阳能敏化染料电池,表现出的光电转化效率可以达到0.86%。这种色素-蛋白形式的光学催化剂可为研发新的光电材料提供理论基础。2)考虑到将GroEL拆分成单环SR1,用以叶绿素a的超分子组装,可能更有利于催化反应中的传质并影响组装体的性能,我们通过透析的方法制备了Chl a@SR1复合体。当SR1结合的叶绿素a越多时,复合体的光学稳定性越高,且可实现对甲基紫精的还原;将比例为1:60的Chl a@SR1复合体组装成太阳能敏化染料电池的光电转化效率可达到1.09%,并对其可能的作用机制进行了探讨。3)另一方面,通过置换反应将叶绿素a转变为铜代脱镁叶绿素a,利用透析法制备了Cu-pheo a@GroEL复合体。研究发现,GroEL并没有提高Cu-pheo a的光稳定性,但可以实现对甲基紫精的还原。比例为1:40的Cu-pheo a@GroEL复合体制备成太阳能电池的光电转化能力比其他两种复合体都低。本部分研究侧面反映了叶绿素中镁离子对其稳定性和光催化性能的重要作用。

关键词：光催化剂叶绿素a 伴侣素光催化

纳米筒状血红素酶的仿生构建及其催化氧化性能和应用研究

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纳米筒状血红素酶的仿生构建及其催化氧化性能和应用研究

作者：王超中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

生物体系中的催化氧化由金属酶催化,在常压、室温和水相的条件下进行,这完全符合绿色化学的理念。自本世纪初以来,许多科学家致力于构建具有催化活性的人工金属酶。而在众多的构建方法中,利用主客体相互作用的方法将客体血红素直接引入... 详细信息

生物体系中的催化氧化由金属酶催化,在常压、室温和水相的条件下进行,这完全符合绿色化学的理念。自本世纪初以来,许多科学家致力于构建具有催化活性的人工金属酶。而在众多的构建方法中,利用主客体相互作用的方法将客体血红素直接引入到主体蛋白中,是目前最为简单直接的方法之一,利用该方法构建的酶称之为人工血红素酶。但是由于蛋白质结构与性质的差异,以及对客体分子结合力的不同,该方法还存在很多问题,如重组体系结构稳定性及功能性不高,选择特异性不突出,理论研究不彻底等。我们仍需要进行更多的人工酶合成及功能化方面的研究,以得到稳定性更好、功能性更完善、催化活性更高的人工酶,扩展其在生物分析和环境监测等方面的应用。本论文主要对人工血红素酶的合成、性质进行了研究,并对其实际应用价值进行了探索。本研究中选用的主题蛋白是伴侣素Gro EL,它是由两个七元环背对背堆叠形成的直径约为13.7nm,长度约为14.6nm的圆筒状结构十四聚体蛋白质复合物,其功能是辅助错误折叠的蛋白进行正确的折叠。在本研究中,它一方面可以作为结合血红素的载体,另一方面可以作为纳米尺度的反应容器。主要内容概述如下:1)本论文通过表面活性剂透析法,利用GroEL和催化活性中心血红素Hemin,合成了具有类过氧化物酶活性的人工金属酶,并考察了温度、p H值、浓度对酶活的影响,以及人工酶的稳定性。Gro EL有效地分散并固定了Hemin分子,并且Gro EL的分子结构没有明显的改变。构建的Hemin-Gro EL人工酶在适宜条件下具有较高的酶活性,并且在催化实验中,其动力学行为遵循乒乓机制。2)使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）等模型底物,成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的比色检测方法。通过比色反应的动力学分析,发现Hemin-Gro EL同样具有类过氧化物酶活性,同时遵循典型的米氏动力学和乒乓机制。基于Hemin-Gro EL的比色检测实验可以实现对溶液中H2O2和葡萄糖的检测。此外,该人工酶也可以用于儿茶酚的氧化去除,为临床分析和环境检测等应用提供了重要的参考依据。3)利用荧光底物高香草酸（HVA）成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的荧光检测方法。经过荧光反应的动力学和底物的竞争性抑制实验分析,表明Hemin-Gro EL人工酶的底物特异性不强,可降低甚至消除其底物抑制作用。Hemin-Gro EL的荧光检测实验,表明该人工酶不仅可以对溶液中H2O2、葡萄糖进行测定,还可用于相关底物酶的检测,如葡萄糖氧化酶,是极具潜力的新型人工酶。

关键词：伴侣素血红素人工酶催化氧化

GroEL-GroES辅助细菌视紫红质折叠的研究

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GroEL-GroES辅助细菌视紫红质折叠的研究

作者：陆欣伟中国石油大学(华东)

学位级别：硕士

蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因... 详细信息

蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因子GroES,是一类非常关键的分子伴侣,许多研究已经证明分子伴侣GroEL-GroES能够辅助多种水溶性蛋白的折叠。近期,本课题组的研究表明,分子伴侣GroEL-GroES也能辅助膜蛋白的折叠,对于膜蛋白的产量及活性都有着明显的促进作用,这一发现对于膜蛋白的合成具有重要的意义。目前对于GroEL-GroES如何辅助膜蛋白的折叠还不清楚,因此难以对这一折叠过程进行进一步的调控。本论文以具有七次跨膜α-螺旋结构的细菌视紫红质为模型,研究GroEL-GroES辅助膜蛋白折叠的过程,期望在阐明这一折叠过程的同时,为调控膜蛋白的折叠提供实验基础。本论文中,我们利用单分子荧光技术,考察了GroEL-GroES在细菌视紫红质折叠中的作用机制,包括其对细菌视紫红质折叠/去折叠中分子构象动态变化的影响。第2章,我们在实验室前期的工作基础上,成功制备了细菌视紫红质BR(0CV130C)、脱辅基细菌视紫红质BO(0C-249C)两个双定点突变体,利用荧光染料AF488和AF647对突变体蛋白进行荧光双标记,对标记后的蛋白样品表征的结果表明双标记成功。还成功制备了GroEL、GroES等蛋白,为下一步利用单分子荧光共振能量转移(sm-FRET)、荧光相关光谱(FCS)等技术研究GroEL-GroES对细菌视紫红质折叠的影响奠定了基础。第3章,我们探索了GroEL/GroES/ATP的不同组合与变性态BR(0C-V130C)和天然态BR(0C-V130C)相结合的动力学和热力学情况,发现ATP作为激活剂,能大大促进GroEL与变性态底物蛋白BR的疏水结合,从而促进对变性态蛋白的重折叠。同时,我们认为ATP、GroES和ATP-GroES能够分别对GroEL的结构产生不同的影响,导致GroEL对特定底物亲和性的变化。热力学实验表明,变性态BR与分子伴侣GroEL结合的亲和力高于天然态BR。第4章,我们利用荧光相关光谱法研究了BR分子自发复性、在GroEL辅助下复性以及GroEL-GroES介导下的BR复性。发现变性态BR分子自发复性时很容易发生聚集,这不利于其折叠成正确的天然状态。分子伴侣GroEL能与容易聚集的变性态BR结合,并且疏散聚集态BR分子。而GroEL-GroES同时存在时,对聚集态的BR分子疏散作用更为明显。GroEL-GroES通过结合BR折叠中间体,减少非天然态BR聚集,从而更有利于底物蛋白折叠成其天然状态。同时,利用单分子荧光共振能量转移技术对BO突变体折叠/去折叠中分子构象的动态变化进行表征,发现BO分子去折叠过程中存在多个不同的集合。BO分子自发复性过程缓慢且复性产率低。GroEL介导BO复性过程中,复性速率有所提高,但是复性产率很低。辅因子GroES和激活剂ATP的合作可以更大化地疏散聚集的BO,从而最大程度地提高变性态BO的折叠速率和折叠效率,并可以再生GroEL活性,促进变性态BO重折叠。

关键词：伴侣素细菌视紫红质单分子荧光共振能量转移荧光相关光谱膜蛋白折叠构象转变