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伯氏致病杆菌IDP16蛋白抑制大蜡螟的免疫反应

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微生物学报 2012年第7期52卷 885-893页

作者：石怀兴曾洪梅邱德文中国农业科学院植物保护研究所农业部有害生物综合治理重点实验室北京100081

【目的】从伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)胞外组分中分离纯化出能够抑制大蜡螟(Galleriamellonella)免疫反应的一种蛋白,研究其在昆虫病原线虫及其共生菌致病过程中的作用。【方法】采用硫酸铵沉淀和柱层析的方法对活性蛋白进行... 详细信息

【目的】从伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)胞外组分中分离纯化出能够抑制大蜡螟(Galleriamellonella)免疫反应的一种蛋白,研究其在昆虫病原线虫及其共生菌致病过程中的作用。【方法】采用硫酸铵沉淀和柱层析的方法对活性蛋白进行分离和纯化,通过体内注射并观察血淋巴黑化进行活性蛋白的筛选;采用荧光微球和琼脂糖小球评价活性蛋白对血细胞吞噬、包被作用的影响;采用双向电泳结合质谱分析对活性蛋白进行鉴定,设计引物用PCR的方法克隆其编码基因,利用pET 30a载体进行原核表达,以亲和层析纯化重组蛋白。【结果】纯化得到一个昆虫免疫抑制蛋白,命名为IDP16,该蛋白可显著抑制大蜡螟血淋巴中的多酚氧化酶活性,降低血细胞的吞噬和包被作用。克隆得到其编码基因并进行了原核表达,重组蛋白仍具有免疫抑制活性。【结论】伯氏致病杆菌产生的IDP16蛋白能够抑制昆虫的免疫反应,在共生菌和宿主昆虫互作过程中起着重要的作用。

关键词：伯氏致病杆菌 IDP16蛋白大蜡螟免疫抑制

伯氏致病杆菌(Xenor habdus bovienii BE)杀虫活性物质的分离和生物测定

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江苏农业学报 2009年第1期25卷 59-67页

作者：段秀峰林茂松李红梅王暄刘维红南京农业大学植物病理学系江苏南京210095

对斯氏线虫（Steinernera feltiae）比利时品系的共生菌伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovienii BE）进行发酵培养，测定结果显示，该菌发酵液对供试昆虫大蜡螟老龄幼虫有很高的血腔毒性。对发酵液硫酸铵盐析和乙酸乙酯抽提物等衍生物进行... 详细信息

对斯氏线虫（Steinernera feltiae）比利时品系的共生菌伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovienii BE）进行发酵培养，测定结果显示，该菌发酵液对供试昆虫大蜡螟老龄幼虫有很高的血腔毒性。对发酵液硫酸铵盐析和乙酸乙酯抽提物等衍生物进行测定，发现共生菌的杀虫物质主要为胞外和胞内蛋白成分，且胞内粗提蛋白活性明显高于胞外蛋白。对两种粗提蛋白进行Marker分子量范围为（1．43-9．72）×10^4的SDS-PAGE分析，发现胞外粗提蛋白在此分子量范围内没有明显的条带，而胞内粗提蛋白则有较明显的5个条带。研究表明胞内粗提蛋白具有较高的热稳定性，测定的盐析最佳硫酸铵饱和度为80％，此粗提蛋白在24h和48h后对昆虫血腔毒性的LD50值分别为4．7316g／L和1．5715g/L；其在5d后对二龄幼虫的口服LD50为253．7579μg／g。胞内粗提蛋白凝胶过滤后呈现4个峰值，分别对其进行SDS-PAGE分析，只有浓度较大的峰值1和4产生明显条带，分子量分别为6．64×10。和（2．01-2．90）×10^4的2种复合蛋白；分别对它们进行血腔和口服毒性生物活性测定，发现分子量为（2．01-2．90）×10^4的2种复合蛋白杀虫活性高于分子量为6．64×10^4蛋白的杀虫活性，其在24h和48h后对昆虫血腔毒性的LD50分别为0．3772g／L和0．1238g/L，其在5d后对二龄幼虫的口服LD50为93．0021μg／g。

关键词：斯氏线虫大蜡螟伯氏致病杆菌血腔毒性 SDS-PAGE 口服毒性

伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

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伯氏致病杆菌SN269菌株的筛选及次生代谢产物研究

作者：张春珍沈阳农业大学

学位级别：硕士

在昆虫病原线虫中寄生的共生菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌;其中与异小杆线虫科(Heterothabditidae)共生的发光杆菌(Phothrabdus),与斯氏线虫科(Steinernematidae)共生的致病杆菌(Xenohrabdus),是共生菌中仅有的的两类菌,他们寄生于3期侵染线虫的肠道内,随着寄主线虫一同进入到昆虫体内,并被释放到昆虫的血腔中,通过释放一系列的对昆虫有抑制分解作用的代谢产物,来杀死昆虫,为共生菌本身和线虫的生长发育和繁殖提供了充足的养分和养料。由于具有广泛的杀虫和抑菌效果,携带共生菌的线虫和线虫-共生菌复合体已经成为具有高效生物活性的新型的生物制剂,在农业上病虫害的生物防治中发挥着重要作用。特别是其中起到关键致病作用的共生菌,能够在发酵过程中合成和分泌多种具有高效抑菌活性和调节作用的代谢产物,对其进行分离纯化及结构鉴定在农业领域具有巨大的挖掘潜力,也将为新生物农药的研发奠定基础。本实验针对共生菌的主要研究方法和结果如下:1.共生菌菌株的分离纯化:本文通过对辽宁省内(抚顺市,丹东市凤城,铁岭市龙首山,铁岭市西丰等)以及省外周边(内蒙古牙克石市博克图,呼伦贝尔市扎兰屯;吉林省白山市长白山等)部分地区的土样进行采集,共得到102个土样;采用white-trap法分离获得了 38株初生型和4株次生型菌株,共计42株。2.目标菌株的筛选:对分离纯化得到的42株共生菌进行小发酵,用大孔树脂吸附法获取共生菌的粗提物。采用TLC检测技术对菌株发酵粗提物进行分析检测,结果表明SN231具有不同于其他所有粗提物的组分。分别采用菌丝生长速率法和菌块移置法测定候选菌株及其粗提物对植物病原真菌的抑制作用。结果表明,SN231菌株及其发酵粗提物均对辣椒疫霉病菌有一定的抑制作用。所以选定其为目标菌株,列入实验室的菌种库给予新的命名SN269,进行下一步实验。***269菌株的鉴定:对SN269菌株进行16SrRNA序列分析。PCR扩增SN269菌株的16S rRNA序列,选择同源序列进行Clustal比对,采用Mega 6.0软件构建系统发育树,结果显示SN269菌株与Xenorhabdus bovienii聚在一起,同源性为100%,所以SN269 菌株属于 Xenorhabdus bovienii,命名为Xenorhabdus bovieniiSN269。***269菌株次生代谢产物分离纯化:对SN269菌株进行液体发酵得到粗提物。然后利用柱层析技术与半制备高效液色谱技术相结合的方法对SN269菌株的次生代谢产物进行分离纯化,获得目标化合物D3。5.D3化合物的结构鉴定及活性研究:经核磁共振波谱及高分辨质谱分析,并结合相关文献,将D3鉴定为madumycin Ⅱ,是Streptogramin中具有高效抑菌活性的抗生素。通过菌丝生长速率法和微量肉汤稀释法测定化合物D3的抑真菌及细菌活性,结果表明化合物D3对辣椒疫霉和番茄灰霉的抑制效果尤为突出(EC50值分别为35.32和35.40μg/mL),并且对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果IC50值为分别为0.13±0.02μg/mL。

关键词：伯氏致病杆菌菌株分离次生代谢产物分离纯化结构鉴定抑菌作用

伯氏致病杆菌SN52菌株次生代谢产物分离纯化及结构鉴定

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伯氏致病杆菌SN52菌株次生代谢产物分离纯化及结构鉴定

作者：田晓美沈阳农业大学

学位级别：硕士

昆虫病原线虫共生菌(entomopathogenic bacteria)与土壤中的线虫共生,主要包括与异小杆线虫共生的发光杆菌和与斯氏线虫共生的致病杆菌属。最近研究表明,致病杆菌能够产生丰富的次生代谢产物,特别是小分子毒素,具有杀虫、抗菌、除草等... 详细信息

昆虫病原线虫共生菌(entomopathogenic bacteria)与土壤中的线虫共生,主要包括与异小杆线虫共生的发光杆菌和与斯氏线虫共生的致病杆菌属。最近研究表明,致病杆菌能够产生丰富的次生代谢产物,特别是小分子毒素,具有杀虫、抗菌、除草等生物活性,已成为重要的新型农用抗生素来源。近年来,我国对致病杆菌的研究主要集中在发酵液活性、杀虫机理等方面,而对其次生代谢产物的分离纯化及生物活性研究较少。本文重点对致病杆菌进行相关研究,主要包括：分离昆虫病原线虫共生菌、筛选活性菌株并鉴定其种属、分离纯化次生代谢产物及鉴定单体化合物、测定单体化合物的生物活性等方面,为开发新型的微生物源农用抗生素奠定基础。结果如下：1.昆虫痫原线虫共生菌的分离：在辽宁地区采集土样146个,以NBTA为分离培养基采用white-tra P法,共分离43株共生菌,其中包含41株初生型菌株和2株次生型菌株。2.具有生物活性的共生菌菌株筛选：对这43株菌进行液体培养,采用大孔树脂吸附的方法提取共生菌的粗提物,采用HPLC检测技术,进行化学筛选,共筛选出9种产物各不相同的菌株发酵粗提物,记为ETi, ET2, ET3, ET4, ET5, ET6, ET7, ET8, ET9。以麦根腐平脐蠕孢、番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫霉、禾谷镰刀菌、立枯丝核菌为靶标菌,以100 μg/mL浓度时的菌丝生长抑制率作为参考,采用平板对峙培养法对以上9种粗提物做活性筛选,抑制率最大的粗提物为ET4,其对番茄灰霉病菌的抑制率为85%,所对应的菌株为SN52。***52菌株的鉴定：对SN52菌株进行生理生化特性测定和16S rRNA序列分析。PCR扩增SN52菌株的16S rRNA序列,选择同源序列进行Clustal比对,采用Mega 6.0软件构建系统发育树,结果显示SN52菌株与Xenorhabdus bovienii聚在一起,同源性为100%,同时结合生理生化特征结果,显示SN52菌株与Xenorhabdus bovienii为同种,将其编号为Xenorhabdus bovienii SN52。***52菌株次生代谢产物的分离纯化：对伯氏致病杆菌SN52进行大批量发酵,采用活性追踪法对其活性成分进行追踪。分别采用硅胶柱层析、凝胶LH-20柱层析和半制备高效液相色谱技术对SN52菌株的活性次生代谢产物进行分离纯化,最终得到6个单体化合物,并分别命名为Mi， M2， M3, M4， Ms， M6。通过波谱综合解析和文献数据对照方法对其进行结构鉴定。结果显示,上述6种单体化合物均为吲哚类化合物,其中5个为已知化合物,分别鉴定为:xenocyloins A(Ms), xenocyloins B(M6). xenocyloins C (M3). xenocyloins D(M4)和xenocyloins E (M2);1个为新化合物,命名为xenocyloinsF(M1)。5. SN521菌株次生代谢产物生物活性测定：以番茄灰霉病菌为靶标病原真菌,百菌清原药为阳性对照,采用平板对峙培养法设置5个浓度梯度测定该6个单体化合物生物活性。结果表明,M1的EC5o为88.44 μg/mL, M2的EC5o为100.94\μg/mL, M3的EC50为43.90μg/mL, M4的 EC50为60.15μg/mL, M5的EC5o为21.78 μg/mL, M6的EC5o为34.43μg/mL。

关键词：伯氏致病杆菌次生代谢产物分离纯化结构鉴定生物活性

伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE的培养条件及杀虫活性物质的初步探索

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伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE的培养条件及杀虫活性物质...

作者：段秀峰南京农业大学

学位级别：硕士

线虫一共生菌复合体具有安全性高、杀虫能力强、杀虫谱广的优点,线虫又具有主动搜索能力,所以具有开发成为新型生物杀虫剂的潜力。本实验采用斯氏线虫Steinernera feltia比利时品种为材料,培养该线虫的共生菌Xenorhabdus bovienii BE,... 详细信息

线虫一共生菌复合体具有安全性高、杀虫能力强、杀虫谱广的优点,线虫又具有主动搜索能力,所以具有开发成为新型生物杀虫剂的潜力。本实验采用斯氏线虫Steinernera feltia比利时品种为材料,培养该线虫的共生菌Xenorhabdus bovienii BE,将共生菌的生长情况和最佳发酵条件进行测定,从而为进一步对该共生菌的研究及发酵液大规模生产提供必要的前提条件;实验对共生菌发酵液及其成分的杀虫活性进行生物测定,寻找该菌的杀虫活性物质,并对活性物质的性质进行初步研究,从而为害虫的生物防治提供新的微生物杀虫资源。本研究对Steinernera feltia共生菌Xenorhabdus bovienii BE的培养特性和最佳培养条件进行测定;逐步对该共生菌发酵液及其成分的杀虫活性进行生物测定,寻找该菌的杀虫活性物质;对杀虫活性物质的性质进行研究并对其血腔,口服LD进行测定。 1斯氏线虫Steinernera feltia共生菌Xenorhabdus bovienii BE的生长情况: 0-6h为延迟期,6-12h为对数生长期,12-22h为稳定期,22h后细菌生长进入衰亡期。在液体NA培养基上,此伯氏致病杆菌的最适培养温度为27.5℃,最佳摇床转速为180r/min,最适pH值范围为7.0～7.5;初始接种量对菌株的生长有明显的影响,最理想的接菌量为6%;250ml三角瓶的最佳装液量为35ml,即最佳装液量为所盛培养基容积的14%。 2共生菌杀虫活性物质的探测及生物测定: 测定结果显示斯氏线虫Steinernera feltiae比利时品系的共生菌伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE发酵液对供试昆虫大蜡螟老龄幼虫有很高的血腔毒性,通过对发酵液硫酸铵盐析和乙酸乙酯抽提物等进行生物测定,发现共生菌的杀虫物质主要为胞外和胞内蛋白成分,且胞内粗提蛋白活性明显高于胞外粗提蛋白。以Marker分子量范围为14.3-97.2kDa为参照,对两种粗提蛋白进行SDS-PAGE分析,发现胞外粗提蛋白在此分子量范围内没有明显的条带,而胞内粗提蛋白则有较明显的五个条带;胞内粗提蛋白在24h和48h后对昆虫的血腔毒性的LD值分别为4.7316g/L和1.5715g/L;其在5天后对二龄幼虫的口服LD为253.7579μg/g。胞内粗提蛋白凝胶过滤后呈现为4个峰值,分别对其进行SDS-PAGE分析,只有浓度较大的峰值1和4产生明显条带,分子量分别为约66.4kDa和20.1-29.0kDa之间的两种复合蛋白;分别对它们进行血腔和口服毒性的生测,发现分子量在20.1-29.0kDa之间的两种复合蛋白活性高于分子量约为66.4kDa的杀虫活性,其在24h和48h后对昆虫的血腔毒性的LD分别为0.3772g/L和0.1238g/L,其在5天后对二龄幼虫的口服LD为93.0021μg/g。 3杀虫粗提蛋白的性质: 研究表明胞内粗提蛋白具有较高的热稳定性,测定的盐析最佳硫酸铵饱和度为80%,通过考马斯亮蓝法所得到的蛋白标准曲线及从中得出的标准方程,从中求得胞外粗蛋白含量为316.67μg/ml,胞内粗蛋白含量为580.89μg/ml。

关键词：斯氏线虫大蜡螟伯氏致病杆菌血腔毒性 SDS-PAGE 口服毒性

温度对2株伯氏致病杆菌生长速度和致病力的影响

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中国生物防治学报 2023年第6期39卷 1455-1462页

作者：张文德李茜童钱秀娟甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

为了明确温度对昆虫病原线虫共生细菌-伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovenii的生长及致病力的影响及其最佳培养条件,该试验通过平板和发酵液培养法,在不同温度处理条件下,对已分离鉴定的2株伯氏致病杆菌0641TY和0657L品系进行培养,研究其生... 详细信息

为了明确温度对昆虫病原线虫共生细菌-伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovenii的生长及致病力的影响及其最佳培养条件,该试验通过平板和发酵液培养法,在不同温度处理条件下,对已分离鉴定的2株伯氏致病杆菌0641TY和0657L品系进行培养,研究其生长速率和其对大蜡螟Galleriamellonella的血腔毒力及胃毒毒力。结果表明:2株伯氏致病杆菌在平板中培养时,30℃条件下伯氏致病杆菌0641TY和0657L的菌落平均直径分别为1653.34和834.84μm,显著大于其他温度;发酵液中培养时,30℃条件下2株菌分别于6和12 h时达到对数生长期,生长速率均显著高于其他温度;30℃培养的2株伯氏致病杆菌发酵液对大蜡螟幼虫有较高的血腔毒力,在侵染72 h校正死亡率均达到100%,而胃毒毒力较弱,侵染96 h致死率分别为50%和46.6%。因此,30℃有利于2株伯氏致病杆菌的生长和保持其毒力。

关键词：伯氏致病杆菌温度生物学特性致病力大蜡螟

胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫0657L生长发育及其共生细菌伯氏致病杆菌0657L的影响

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昆虫学报 2024年第1期67卷 38-47页

作者：李茜童陈红王兴铎钱秀娟甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

【目的】为探讨胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫Steinernema kraussei 0657L生长发育及其共生细菌的影响。【方法】吸取1.5 mL 3000头/mL的卡森斯氏线虫0657L悬浮液侵染大蜡螟Galleria mellonella 3龄幼虫,25℃培养24 h后分离卡森斯... 详细信息

【目的】为探讨胰岛素对昆虫病原线虫卡森斯氏线虫Steinernema kraussei 0657L生长发育及其共生细菌的影响。【方法】吸取1.5 mL 3000头/mL的卡森斯氏线虫0657L悬浮液侵染大蜡螟Galleria mellonella 3龄幼虫,25℃培养24 h后分离卡森斯氏线虫0657L的共生细菌伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovenii 0657L;分别用1∶500胰岛素和1∶5000胰岛素处理伯氏致病杆菌0657L后饲喂卡森斯氏线虫0657L,借助体视显微镜观测伯氏致病杆菌0657L在胰岛素处理1~6 d时的菌落直径并计算生长速率,计算卡森斯氏线虫0657L寿命、存活率、每30 s头部摆动次数和每30 s吞咽次数,评价其平均寿命、运动能力及吞咽能力。【结果】与空白对照组相比,1∶5000胰岛素和1∶500胰岛素处理组伯氏致病杆菌0657L的菌落直径在对数生长期(处理2 d时)可分别增大77.2%和54.0%,生长速率可由空白对照组的68.0μm/d分别提高至120.4和104.7μm/d;卡森斯氏线虫0657L寿命分别延长27.3%和45.5%;卡森斯氏线虫0657L 3龄幼虫每30 s头部摆动次数分别提高56.3%和74.7%,3和4龄幼虫及成虫每30 s吞咽次数分别提高50.9%和65.5%,26.8%和35.2%及23.7%和21.1%。【结论】胰岛素可以显著促进卡森斯氏线虫0657L共生细菌伯氏致病杆菌0657L单菌落的生长和提高其生长速率,能够通过伯氏致病杆菌0657L间接延长卡森斯氏线虫0657L的寿命,提高昆虫病原线虫的运动和吞咽能力。本研究结果可以为延长昆虫病原线虫商品货架期提供科学依据,为昆虫病原线虫的高效生物防治提供理论基础。

关键词：卡森斯氏线虫伯氏致病杆菌胰岛素昆虫病原线虫共生细菌生长发育寿命运动吞咽

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伯氏致病杆菌蛋白酶抑制剂防治白粉虱的初步研究

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伯氏致病杆菌蛋白酶抑制剂防治白粉虱的初步研究