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伯克氏菌对群结腐霉引起的花生果腐病的生防潜力

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花生学报 2023年第2期52卷 52-60,81页

作者：于静宋新颖李莹何康郭志青许曼琳张霞迟玉成山东省花生研究所山东青岛266100

花生果腐病是一种世界性的花生病害,群结腐霉是其主要致病菌之一,在花生生产过程中造成重大经济损失,生物防治是一种有效的绿色防控手段。为了控制花生果腐病的发生,从健康的花生植株上分离获得39株内生细菌,并筛选出5株对群结腐霉菌具... 详细信息

花生果腐病是一种世界性的花生病害,群结腐霉是其主要致病菌之一,在花生生产过程中造成重大经济损失,生物防治是一种有效的绿色防控手段。为了控制花生果腐病的发生,从健康的花生植株上分离获得39株内生细菌,并筛选出5株对群结腐霉菌具有明显拮抗活性的菌株。结果表明,基于16S核糖体RNA序列和RecA序列,有5个菌株均被鉴定为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia),其中,菌株PRI08对群结腐霉菌菌丝生长显示出较强的拮抗活性。通过温室和田间试验,接种洋葱伯克霍尔德菌PRI08后,再用群结腐霉侵染花生植株,发病率分别降低了29.5%和11.83%。此外,洋葱伯克霍尔德菌PRI08对花生有明显的促生作用,增加主茎高、侧枝长、荚果数量、饱果率和荚果产量,分别为20.44%,19.98%,26.61%,20.36%和21.52%。本研究表明,洋葱伯克霍尔德菌PRI08具有作为花生果腐病生物防治剂和花生生长促进菌的潜力。

关键词：群结腐霉内生菌伯克氏菌生物防治

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伯克氏菌双价转化载体的构建及结构鉴定

湖北农业科学 2010年第4期49卷 775-778页

作者：黄玉杰张新建杨合同陈凯魏艳丽任艳山东省科学院中日友好生物技术研究中心/山东省应用微生物重点实验室济南250014 山东理工大学生命科学学院山东淄博255049

通过PCR技术分别在已有的几丁质酶基因和内切葡聚糖酶基因前端加入了SD序列,通过酶切、连接将上述两个基因串连,构建了自杀性转座重组质粒,为进一步构建转双价基因生防菌奠定了基础。

关键词：伯克氏菌双价基因自杀性质粒串连

芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表达

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中国生物防治 2006年第S1期22卷 72-77页

作者：黄玉杰杨合同周红姿李纪顺吴远征扈进冬山东省科学院中日友好生物技术研究中心/山东省应用微生物重点实验室济南250014

采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp,含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架,起始密码子位于211bp,终止密码子位于1998bp,共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的枯草芽孢杆菌几丁质酶核苷酸具有... 详细信息

采用PCR技术扩增到枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的编码序列。片段共2227bp,含有一个具有1788个核苷酸的开放阅读框架,起始密码子位于211bp,终止密码子位于1998bp,共编码氨基酸605个。序列比较发现同已发表的枯草芽孢杆菌几丁质酶核苷酸具有99.39%的同源性。将该基因与大肠杆菌-伯克氏菌穿梭质粒pRK415连接,获得重组质粒pRChi113。重组质粒电击转入伯克氏菌B418中,获得工程菌株B418-9、B418-13。与野生菌株B418相比,平板拮抗试验表明,工程菌株B418-9、B418-13对大丽花轮枝孢、立枯丝核菌、麦根腐长蠕孢、禾谷丝核菌抑菌效果明显提高。

关键词：几丁质酶克隆转化伯克氏菌

通过染色体整合几丁质酶基因提高伯克氏菌生防能力

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中国生物防治学报 2010年第S1期26卷 47-54页

作者：张新建黄玉杰任艳张广志周红姿杨合同山东省科学院中日友好生物技术研究中心/山东省应用微生物重点实验室济南250014 山东理工大学生命科学学院淄博255049

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和... 详细信息

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和几丁质酶活性检测,结果证实几丁质酶编码基因已整合到伯克氏菌B418-37染色体DNA上并能表达几丁质酶。生物学特性研究发现几丁质酶基因整合到伯克氏菌染色体中,没有影响野生菌的解磷、解钾、固氮及其在植物根际的定殖能力。平板抑菌试验和温室盆栽试验显示,与野生型相比,该工程菌株对多种病原真菌的抑菌效果增强,说明几丁质酶在植物病害的防治中具有重要作用。上述结果说明通过染色体整合几丁质酶基因是获得多功能生防工程菌的有效途径之一。

关键词：生物防治几丁质酶伯克氏菌转座

接种伯克氏菌D54对东南景天吸收富集Cd的影响

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农业环境科学学报 2017年第3期36卷 449-457页

作者：张亚经马成仓郭军康韩磊冯人伟冯雪敏曹雲清王瑞刚天津师范大学生命科学学院天津300387 农业部环境保护科研监测所天津300191 陕西科技大学环境科学与工程学院西安710021 天津农学院农学与资源环境学院天津300384

通过水培盆栽试验,利用非损伤微测等技术手段,研究了接种伯克氏菌D54对超积累生态型东南景天(HE)和非超积累生态型东南景天(NHE)不同组织中Cd、Zn、Fe、Mg和Mn含量、根尖Cd^(2+)动态吸收以及Cd的转移系数的影响。结果发现,HE茎、叶中Cd... 详细信息

通过水培盆栽试验,利用非损伤微测等技术手段,研究了接种伯克氏菌D54对超积累生态型东南景天(HE)和非超积累生态型东南景天(NHE)不同组织中Cd、Zn、Fe、Mg和Mn含量、根尖Cd^(2+)动态吸收以及Cd的转移系数的影响。结果发现,HE茎、叶中Cd、Zn含量,茎/根、叶/根Cd的转移系数以及根尖不同部位Cd^(2+)内流速率均显著高于NHE。Cd处理显著增加了HE和NHE根、茎、叶中Fe和Zn的含量,以及茎中Mg的含量;另外,Cd处理显著降低了HE根、茎、叶中Mn的含量,但却显著增加了NHE根和茎中Mn的含量。伯克氏菌D54处理显著降低了HE和NHE茎、叶中Cd、Fe、Mg、Mn和Zn的含量,茎/根、叶/根Cd的转移系数以及根尖不同部位Cd^(2+)的内流速率。这表明HE对Cd的转移和富集能力显著高于NHE,且HE对Cd的超富集能力与根部对Cd的强吸收能力密切相关。Cd处理促进了HE和NHE对Fe、Zn和Mg的富集,抑制了HE对Mn的富集和促进了NHE对Mn的富集,可能与HE超富集Cd和Mn产生竞争有关。伯克氏菌D54能减少HE和NHE对Cd的吸收和富集,同时导致Fe、Mg、Mn和Zn的富集减少。

关键词：东南景天镉伯克氏菌吸收富集

定量PCR快速检测牙科综合治疗椅用水中伯克氏菌及变异蛋白菌分布

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定量PCR快速检测牙科综合治疗椅用水中伯克氏菌及变异蛋白菌分布

作者： Huang Po Jui 山东大学

学位级别：硕士

研究背景:牙科治疗椅供水管路(Dental Unit Waterlines)中的微生物污染最近几年广为被医疗各界关注,主要讨论管道的供水一旦被污染,可疑致病菌就能够通过不同方式进入患者口腔,或化成水气雾散发在科诊室的空气中,对医务人员和患者都是... 详细信息

研究背景:牙科治疗椅供水管路(Dental Unit Waterlines)中的微生物污染最近几年广为被医疗各界关注,主要讨论管道的供水一旦被污染,可疑致病菌就能够通过不同方式进入患者口腔,或化成水气雾散发在科诊室的空气中,对医务人员和患者都是一种潜在的危险。在之前采用常规培养的方法及16s高通量测序研究结果表明,牙科治疗椅水系统细菌污染主要由放线菌、葡萄球菌和大肠杆菌等等引起。根据目前临床的标准,牙科治疗的供应用水不完全符合微生物学要求的微生物参数,由于牙椅使用的消毒模式和每天频率和年限也不同,其被污染的可能性和程度也不一样,使用的水管道中的细菌污染及主要的可疑致病菌除了目前研究常见的几种之外还有哪些是危险致病菌,是本课题研究的目的。综上所述,牙科治疗椅供水系统中的细菌污染,已经是医源性感染重要危险因素,对牙科用水的消毒和微生物监控也成为目前院感工作者关心的问题之一。目的:本研究的目的是调查某大型口腔医院牙科治疗椅中高速手机及其接头的供水系统管道遭到口腔细菌污染的情况,借此通过高速手机水路调查了解管道细菌污染的现状,探究进一步改进消毒手段的必要性及相关策略。方法:对经过常规消毒的牙科治疗椅进行采样。随机抽取医院20台牙科治疗椅的水样(从高速手机取样),设为系统水样(20例),同时取得实验室蒸馏水样(1例)作为阴性对照。封口后存放在-4℃环境下待测,随机抽取样本5例做16s高通量测序后拟订可疑微生物,采用定量PCR检测供水系统内的伯克氏菌和变异蛋白菌分布,为院感控制提供实验数据和依据。结果:通过一般培养的方法,结果表明牙科治疗椅的医生用高速手机中均验出以10秒组培养结果菌数最多,检测结果符合国家标准要求。16sDNA的筛选结果表明葡萄球菌、链球菌、放线菌,放线菌居多。而在定量PCR的实验中显示伯克氏菌及变异蛋白菌在检出的微生物中占据重要位置。结论:在这次分子生物检验结果中可以确认,Burkholderia和Proteobacteria两种细菌确实存在在牙科综合治疗椅里,其在水道中的含量可能与使用频率相关。如何防止细菌污染和主要种的细菌病防治需要进一步的研究和探讨.总之,它已被证明严重的牙科水系统污染,不仅仅是钻消毒问题的一部分,而是最重要的医院内感染。水的使用和预防和控制口腔消毒是当务之急。在PCR研究中洁牙机的含量相对都是高于其他水样本的。而与蒸馏水的阴性对照相比两个菌种都是很明显的增高。综上所述伯克氏菌及变异蛋白菌都是高含量存在于用水量多的牙科综合治疗椅中的(p<0.05)。

关键词：牙科治疗椅高速手机伯克氏菌变异蛋白菌

油桐枯萎病拮抗菌伯克氏菌Burkholderia arboris（Ba1）的分离鉴定及拮抗作用研究

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油桐枯萎病拮抗菌伯克氏菌Burkholderia arboris（Ba1）的分离鉴...

作者：梁晓洁中国林业科学研究院

学位级别：硕士

油桐(Vernicia fordii)是我国四大木本油料植物之一,所生产的桐油是世界上最优质的干性植物油之一,传统用作涂料、油漆,现用于大规模集成电路板的浸渍材料,在航天科工、电子科技、医疗卫生上有着不可或缺的用途。作为油桐的主产国和原产... 详细信息

油桐(Vernicia fordii)是我国四大木本油料植物之一,所生产的桐油是世界上最优质的干性植物油之一,传统用作涂料、油漆,现用于大规模集成电路板的浸渍材料,在航天科工、电子科技、医疗卫生上有着不可或缺的用途。作为油桐的主产国和原产地,我国油桐栽培利用历史悠久。但由尖孢镰刀菌油桐专化型(Fusarium oxysporum ***,Fof-1)造成的油桐枯萎病(俗称“桐瘟”),已在全国8个省份90多个县市发生病害,对油桐产业造成毁灭性破坏,经济损失巨大,严重威胁着全国近百万公顷的油桐林。植物枯萎病是植物十大真菌病害之一,已对全世界120余种植物栽培种发生危害,目前尚无有效防治措施,特别是生物防治有效菌株缺乏。作为林木,油桐杂交和分子抗性育种耗时长、难度大;化学防治易产生农药残留并且污染环境,而微生物防治具有生态、持续、高效等优点。我们前期在油桐枯萎病林发现大面积的油桐出现感染枯萎病的症状,但是极少部分油桐植株生长正常、没有发病。为提供有效生防菌株以防治油桐枯萎病,本研究以感、抗枯萎病油桐植株为研究对象,首先分析感、抗病油桐根际微生物群落结构;从油桐根中分离和鉴定油桐枯萎病拮抗菌,获得了油桐枯萎病拮抗菌伯克氏菌Burkholderia arboris,命名为Ba1,并进一步分析伯克氏菌Ba1的拮抗能力和拮抗化合物。取得的主要研究结果如下:(1)感、抗油桐根际微生物结构差异显著,伯克氏菌是抗病油桐根际主要富集拮抗菌之一。在油桐枯萎病区采集感、抗枯萎病的油桐根,收集根际土,进行细菌和真菌高通量测序,油桐根际土微生物群落结构分析结果显示,病原菌镰刀菌属(Fusarium sp.)可以显著区分感、抗病油桐组,进一步发现拮抗菌伯克氏菌(Burkholderia sp.)可以区分感病和抗病油桐组。同时取感病油桐区的土壤种植易感枯萎病的杨树(Populus deltoides×***)、番茄(Solanum lycopersicum)以及拮抗枯萎病的水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays),对这四种植物根际土菌群结构分析发现,镰刀菌属以及伯克氏菌属可以显著区分这两组植物,伯克氏菌在具有拮抗枯萎病能力的水稻和玉米根际显著富集。(2)油桐枯萎病拮抗菌伯克氏菌Ba1的分离和鉴定。用特定的培养基-MEA培养基(含双抗)从油桐根和根际土中分离、筛选拮抗菌,发现伯克氏菌分离数量远超其他拮抗菌,并且伯克氏菌菌株拮抗效果优于其他拮抗细菌。通过特异性16S r RNA引物PCR扩增并初步鉴定为Burkholderia arboris,将其命名为Ba1;进一步构建伯克氏菌属内的系统进化树,发现Ba1属于伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc),Bcc是伯克氏菌属内紧密相关的菌种,在促进植物生长、生物防治植物病虫害和生物修复方面的生物技术应用得到了广泛的研究。建立了从油桐根和根际土中快速高效分离伯克氏菌的方法,将分离鉴定到的伯克氏菌菌种进行专利保藏,保藏号为CGMCC No.16905。(3)伯克氏菌Ba1对枯萎病菌等多种植物病原菌有拮抗作用。对分离的伯克氏菌拮抗能力进行了测定,通过对峙实验发现伯克氏菌Ba1对油桐枯萎病菌(*** ***,Fof-1)、黄瓜枯萎病菌(*** ***)、果生链核盘菌(Monilinia fructigena)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、禾谷镰刀菌(***)等植物病原真菌都具有明显拮抗效果。光学显微镜观察发现Ba1对峙条件下引起Fof-1菌丝孢子异常。通过伯克氏菌菌剂单因素实验确定伯克氏菌Ba1拮抗菌剂为King A以及King A+Fe培养基,将菌剂浸泡油桐种子的萌发实验发现,King A培养基可以促进种子的萌发。(4)伯克氏菌Ba1产生哌嗪二酮类和吡咯并吡嗪酮类具有拮抗作用的化合物。首先通过隔板实验确定伯克氏菌Ba1发挥抑菌作用不是通过产生挥发性物质;其次,对峙实验结果表明,伯克氏菌Ba1非挥发性的粗提物对油桐枯萎病菌具有抑制作用。进一步通过超高效液相串联飞行时间质谱(UPLC-MS-MS)分析Ba1的粗提物,初步确定化合物类型;进一步利用化合物的相应标品进行液相质谱(LC-MS)鉴定,确定伯克氏菌产生了9个化合物,属于哌嗪二酮类化合物(Diketopiperazines,DKPs)和吡咯并吡嗪酮类化合物。施加纯化的DKPs发现,DKPs对油桐枯萎病病菌具有很显著的抑菌效果,DKPs类化合物被报道具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗疟疾等多种生物活性,吡咯并吡嗪酮类化合物具有消炎和抗肿瘤活性。这两类化合物生物合成

关键词：伯克氏菌油桐枯萎病菌根际微生物拮抗作用化合物

应用噬菌体重组酶构建伯克氏菌新型遗传操作系统及其应用

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应用噬菌体重组酶构建伯克氏菌新型遗传操作系统及其应用

作者：史洪波山东大学

学位级别：硕士

伯克氏菌(Burkholderia)是伯克氏菌科的一个属,属于革兰氏阴性菌,广泛存在于水、土壤等环境中。随着基因组测序技术的发展,越来越多的伯克氏菌基因组被测序。通过对伯克氏菌属基因组进行生物信息学分析,我们发现在伯克氏菌属中存在着大... 详细信息

伯克氏菌(Burkholderia)是伯克氏菌科的一个属,属于革兰氏阴性菌,广泛存在于水、土壤等环境中。随着基因组测序技术的发展,越来越多的伯克氏菌基因组被测序。通过对伯克氏菌属基因组进行生物信息学分析,我们发现在伯克氏菌属中存在着大量沉默的NRPS/PKS生物合成基因簇,具有潜在的次生代谢产物合成潜力。由于伯克氏菌属缺乏高效简捷的遗传操作方法,所以对伯克氏菌属的基因组功能的研究进展缓慢。为了加快对伯克氏菌属基因组研究的步伐,在伯克氏菌属中建立一套高效、简捷的遗传操作系统十分必要。Red/ET同源重组技术可以用来精确的修饰大肠杆菌的基因组,其中,RecET同源重组蛋白源自大肠杆菌Rac前噬菌体,Redαβγ同源重组蛋白源于大肠杆菌的λ噬菌体的Red操纵子。RecET和Redαβγ同源重组技术大大提高了大肠杆菌中的重组效率,并为遗传修饰提供了有效的技术方法。其中,RecE和Redα具有5’-3’的核酸外切酶活性,RecT和Redβ是DNA单链退火蛋白,Redγ能够抑制具有核酸外切酶活性的RecBCD蛋白对外源线性DNA的降解,从而提高重组效率。由于同源重组蛋白具有一定的宿主特异性,RecET和Redαβγ在其他的革兰氏阴性菌中效率很低或者不发挥作用。如果两种蛋白质具有30%左右的同源性,那么它们可能具有相似的功能。我们分别以RecE、RecT、Redα、Redβ的氨基酸序列为模板,使用NCBI的BlastP在线工具挖掘伯克氏菌属的同源重组蛋白。在伯克氏菌及其噬菌体基因组中搜索大肠杆菌λ噬菌体Red操纵子或者大肠杆菌Rac前噬菌体RecET操纵子类似的同源蛋白,我们分别在Burkholderia ***8、Burkholderia ***49和Burkholderia ***23 中找到了与 RecET 类似的操纵子,分别是EThedu8、EThji49和ETh1h2ei23。在这三个操纵子的基础上,我们建立了不同的伯克氏菌属同源重组酶的表达质粒,作为不同伯克氏菌属中的理想的遗传修饰操作工具。通过对同源重组蛋白功能检测,确定了具有重组功能的蛋白。在此基础上,我们在Burkholderia glumae PG1中进行系统地电转条件和重组条件的优化。将构建的新型同源重组系统转化到几种不同的伯克氏菌中进行基因组修饰,成功激活了 3个沉默的NRPS/PKS基因簇。说明了该新型同源重组系统可以广泛应用与伯克氏菌属中。应用噬菌体重组酶构建新型同源重组系统,为伯克氏菌属提供了高效的遗传操作工具,新型同源重组系统将会被广泛应用于伯克氏菌属基因组的功能研究及遗传修饰。

关键词：伯克氏菌 Red/ET同源重组基因工程生物合成基因簇

二氧化碳升高联合固氮伯克氏菌对杨、柳树富集重金属的研究

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二氧化碳升高联合固氮伯克氏菌对杨、柳树富集重金属的研究

作者：张春燕广西大学

学位级别：硕士

杨树、柳树具有较强的富集重金属的能力,在修复重金属污染土壤方面有很大的潜力。本论文利用土培试验,研究了Cd、Zn、Pb复合污染对14个不同杨、柳树品种生长和富集重金属能力的差异。结果发现,南林895和苏柳795重金属含量高,但对重金属... 详细信息

杨树、柳树具有较强的富集重金属的能力,在修复重金属污染土壤方面有很大的潜力。本论文利用土培试验,研究了Cd、Zn、Pb复合污染对14个不同杨、柳树品种生长和富集重金属能力的差异。结果发现,南林895和苏柳795重金属含量高,但对重金属的吸收量较小;61-1生物量有下降但重金属含量最高,南林95重金属含量较低但生物量较高,因而61-1和南林95的重金属总吸收量较高;61-1和南林895品种对Cd和Zn具有高的转运系数和富集系数。以正常二氧化碳浓度作为对照,研究二氧化碳和伯克氏菌联合对3个杨、柳树品种生长、生理生化特性和重金属吸收的影响。结果表明： 1、二氧化碳浓度升高联合伯克氏菌显著降低南林895根的生物量和中林2001叶、茎生物量,高浓度污染下增加中林2001根生物量。 2、二氧化碳浓度升高联合伯克氏菌能显著增加杨树的GR活性,而在高浓度污染下,还能显著提高杨树(南林895)CAT、POD、SOD的活性。 3、二氧化碳浓度升高联合伯克氏菌可降低低浓度污染下杨树的MDA含量,而提高高浓度污染下的MDA含量。 4、二氧化碳浓度升高联合伯克氏菌能显著提高杨树Cd含量以及南林895叶中和苏柳795根中Zn含量,能显著提高高浓度污染下南林895体内的Pb含量,能显著降低低浓度污染下苏柳795的叶、根和高浓度污染下的根中Pb含量。 5、二氧化碳浓度升高联合伯克氏菌显著增加高浓度污染下南林895叶中重金属总吸收量,而降低中林2001叶、茎中的总吸收量,能降低苏柳795叶和根中Pb总吸收量。

关键词：杨、柳树二氧化碳伯克氏菌 Cd、Zn、Pb复合污染生理生化