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传染性造血器官坏死病毒-Sn1203株的基因型及糖蛋白的生物信息学分析

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中国水产科学 2014年第1期21卷 180-188页

作者：徐黎明刘红柏尹家胜卢彤岩中国水产科学研究院黑龙江水产研究所黑龙江哈尔滨150070

利用鲤（Cyprinuscarpio）上皮细胞（epitheliaomapapulosumcyprini，EPC）培养传染性造血器官坏死病毒．Sn1203分离株（IHNV-Sn1203），根据GenBank中IHNVG蛋白基因开放阅读框（openreadingflame，ORF）的序列设计引物（GenBank序列编号AB288207），采用RT-PCR的方法克隆得到IHNV-Sn1203株G蛋白全长ORF，克隆至表达载体pET27b（＋）中，构建了pET27-G重组质粒，并进行了测序分析。生物信息学分析结果显示，IHNV-Sn1203株G蛋白基因序列长度为1527bp，与韩国株具有最高的核酸同源性（96．86％）和氨基酸同源性（97．05％）。该基因编码508个氨基酸残基，推导分子量约为56．55kD，等电点为6．15；氨基酸序列分析表明，G蛋白富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，存在28个潜在的磷酸化位点；存在4个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点；G蛋白N端含有20个氨基酸的信号肽；亲水性大于输水性；位于483～508位氨基酸存在一跨膜区；抗原表位预测显示抗原性良好；系统进化树分析显示，IHNV-Snl203株与日本株和韩国株聚为一簇，都属于JRt基因型。

关键词：传染性造血器官坏死病毒糖蛋白生物信息学分析 IHNV基因型

传染性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测技术的建立

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动物医学进展 2017年第3期38卷 43-49页

作者：尹伟力刘瑶倪杨帆张四化岳志芹孙涛烟台出入境检验检疫局山东烟台264000 荣成出入境检验检疫局山东荣成264300 武汉市农业检测中心湖北武汉430003 武汉市动物疫病预防控制中心湖北武汉430003 山东出入境检验检疫局技术中心山东青岛266000

根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能... 详细信息

根据传染性造血器官坏死病毒(IHNV)基因序列,设计了IHNV最为保守的指纹序列,以及测序引物,建立了IHNV焦磷酸测序检测方法。对所构建的IHNV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测。结果表明,所建立的方法特异性好,在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒,检测方法灵敏度高,最低检出核酸量为10pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究,选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV检测。结果显示,焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RTPCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本,该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。

关键词：传染性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测

传染性造血器官坏死病毒微型基因组表达干扰素对病毒的抑制效应

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淡水渔业 2016年第1期46卷 3-8,17页

作者：王会英蒋烨赵丽丽唐丽杰乔薪瑗姜艳平崔文李一经刘敏东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 东北农业大学动物科学与技术学院哈尔滨150030

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两... 详细信息

为构建传染性造血器官坏死病毒(IHNV HLJ-09)微型基因组并表达虹鳟IFN,采用RT-PCR扩增IHNV HLJ-09株的N、P、L、G和NV蛋白基因并亚克隆入真核表达载体pCI中,构建辅助质粒pCI-N、pCI-P、pCI-L、pCI-G和pCI-NV;将扩增获得的IHNV基因组两末端序列、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因、虹鳟I型干扰素(IFN)基因克隆到真核表达载体pCI中构建出表达EGFP的IHNV微型基因组pCI-LFGT和表达IFN的IHNV微型基因组pCI-LFIT;将pCI-LFIT质粒转染已接种IHNV HLJ-09毒株的EPC细胞,实时荧光定量PCR法测定细胞中IHNV G基因RNA。结果显示:构建的微型基因组不论与辅助病毒还是与5个辅助质粒共转染,外源基因均能正确表达;pCI-LFIT质粒转染已接种病毒的EPC细胞组与对照组相比其中的病毒核酸显著减少。

关键词：传染性造血器官坏死病毒辅助质粒虹鳟Ⅰ型干扰素微型基因组

传染性造血器官坏死病毒抗原表位富集区的原核表达及应用

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淡水渔业 2015年第2期45卷 49-55页

作者：陶健徐黎明刘淼赵景壮曹永生卢彤岩尹家胜刘红柏中国水产科学研究院黑龙江水产研究所哈尔滨150070

以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆... 详细信息

以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为0.25 mmol/L时,37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白相对分子质量约为14 000,符合预期大小,并以包涵体的形式表达,4 h时目的蛋白表达量最大。蛋白经变性、复性处理后获得不带任何标签的纯化蛋白,并利用该蛋白制备兔抗血清。ELISA结果显示,兔抗血清的效价为1∶80 000,说明制备的兔抗血清能够识别表达的重组蛋白;间接免疫荧光结果表明兔抗G蛋白血清具有良好的特异性,并且与VHSV参考毒株没有任何交叉反应。

关键词：传染性造血器官坏死病毒 G蛋白原核表达抗血清

传染性造血器官坏死病毒Sn1203株全基因组序列及系统进化分析

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水产学杂志 2020年第2期33卷 1-9页

作者：赵景壮徐黎明任广明董莹曹永生邵轶智刘红柏尹家胜卢彤岩中国水产科学研究院黑龙江水产研究所黑龙江哈尔滨150070

本课题组于2012年从中国东部的虹鳟鱼养殖场分离得到了严重威胁我国鲑鳟鱼养殖的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)IHNV-Sn1203病毒株。根据GenBank中收录的IHNV病毒株的序列设计引物,将IHNV-Sn1203基因组序列分成5个片段进行RT-PCR克隆,最... 详细信息

本课题组于2012年从中国东部的虹鳟鱼养殖场分离得到了严重威胁我国鲑鳟鱼养殖的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)IHNV-Sn1203病毒株。根据GenBank中收录的IHNV病毒株的序列设计引物,将IHNV-Sn1203基因组序列分成5个片段进行RT-PCR克隆,最终得到完整的IHNV-Sn1203基因组序列。利用Lasergene和MEGA 5.0软件分析了IHNV-Sn1203株的全基因组序列、基因组编码蛋白、基因组末端和未翻译序列、以及病毒基因同源性和系统发育。结果发现,IHNV-Sn1203基因组全长11131nts,共编码6个病毒蛋白,大小分别为核蛋白(N)1176nts、磷蛋白(P)693nts、基质蛋白(M)588nts、表面糖蛋白(G)1527nts、聚合酶蛋白(L)5961nts和非结构蛋白(NV)336nts。IHNV-Sn1203株各基因间均具有保守的基因终止序列(Gene end,GE)、基因间序列(Intergenic regions,IG)、基因起始序列(Gene star,GS)及Kozak序列,以确保病毒基因的转录和翻译效率。系统进化分析发现,IHNV分为E、U、M、L和J共5个基因型,其中IHNV-Sn1203株与中国其他IHNV株具有显著的亲缘关系,属于J基因型中的J Nagano亚型。由G基因的进化分析发现,J基因型的病毒与U基因型亲缘关系最近,推测IHNV病毒最初可能通过进口鱼卵的方式由U基因型引入,随时间的推移逐渐进化为J基因型。

关键词：虹鳟传染性造血器官坏死病毒全基因组序列系统进化分析

传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

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大连海洋大学学报 2011年第3期26卷 232-237页

作者：韩硕赵前程吴斌李叶王玫大连海洋大学食品工程学院辽宁大连116023 辽宁出入境检验检疫局辽宁大连116001

利用RTG-2细胞对传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR-Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786 bp的基因纯化、克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与国内外已... 详细信息

利用RTG-2细胞对传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR-Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786 bp的基因纯化、克隆至pMD18-T载体中进行序列测定,并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。结果表明:此病毒的核酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.3%和93.6%;翻译出的氨基酸序列与标准毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分别为96.1%和93.5%。系统进化树分析结果表明,此毒株与中国近期公布的毒株zyx有密切的亲缘关系。

关键词：传染性造血器官坏死病毒纯化克隆序列分析

传染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增检测方法的建立和初步应用

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淡水渔业 2019年第3期49卷 66-70页

作者：何亚鹏陈怡静时晓张宝莉温战华陈春山李博杜迎春北京市水生野生动植物救护中心北京102100 郑州外国语新枫杨学校郑州450000

实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法( reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒( infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64 ℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H 2 O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10^-4 μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。

关键词：传染性造血器官坏死病毒鲑鳟环介导等温扩增核蛋白基因

传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及其免疫学鉴定

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传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及其免疫学鉴定

作者：陶健南京农业大学

学位级别：硕士

鱼类传染性造血器官坏死病(Infectious hematopietic necrosis, IHN)是一种由传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)引起的严重危害鲑鳟鱼类的主要疾病之一。受发病鱼的种类及大小、毒株及环境因素的... 详细信息

鱼类传染性造血器官坏死病(Infectious hematopietic necrosis, IHN)是一种由传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV)引起的严重危害鲑鳟鱼类的主要疾病之一。受发病鱼的种类及大小、毒株及环境因素的影响,IHN可造成鱼苗近100%的死亡率。至今IHNV已经扩散至美洲、欧洲、澳洲及亚洲的十余个国家。自上世纪九十年代,我国虹鳟鱼主产区多次遭遇到IHN的困扰,虹鳟鱼产量急剧下降,严重阻碍了我国冷水性鱼养殖业的健康可持续发展。因此,传染性造血器官坏死病的诊断和防治日益引起人类的重视。IHNV囊膜表面有一个糖蛋白(Glycoprotein, G)突起。G蛋白在参与细胞受体与病毒的识别和结合等过程中起着非常重要的作用,并且与病毒的毒力相关。此外,G蛋白还是病毒的主要抗原,存在保护性抗原决定簇,能够诱导机体产生特异性中和抗体。因此,G蛋白及其抗体的制备在IHNV诊断试剂的开发、G蛋白功能的研究及基因工程疫苗的研制中具有重要的作用。我国现行IHNV毒株与欧关等国家的IHNV流行毒株基因型均有所不同,有可能会导致G蛋白免疫原性改变。因此,针对我国IHNV毒株的免疫学检测方法的建立极为必要。而目前,以全长G蛋白为抗原制备的多抗与病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicemia virus, VHSV)存在交叉反应。针对上述问题,本研究在生物信息学分析的基础上,对我国现行IHNV毒株G蛋白进行截短表达和抗血清的制备,旨在建立我国现行IHNV的免疫学检测方法。本研究以本实验室分离保存的IHNV-Sn1203 (GenBank accession no. KC660147)分离株基因组RNA提取物为模板,利用RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白部分基因序列(375 bp)(命名为short G)。将其插入到表达载体pET-27b中,构建重组表达质粒pET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为1 mM时,37℃诱导表达4 h时目的蛋白表达量最大,SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白约为13 kDa,符合预期大小,以包涵体的形式表达。利用8 M的尿素进行蛋白变性,2 M的尿素复性处理后获得高纯度的不带任何标签的纯化蛋白,利用该蛋白制备兔抗血清。ELISA结果显示,该兔抗血清与重组蛋白的反应效价为1：80000,说明制备的兔抗血清能够识别表达的重组蛋白,该重组蛋白具有良好的免疫原性;该兔抗血清与IHNV的反应效价为1：40000,该结果表明重组short G蛋白能正确折叠,具有与天然表面蛋白相当的免疫原性;间接免疫荧光结果表明兔抗G蛋白血清具有良好的特异性,与VHSV参考毒株没有任何交叉反应。上述结果表明本研究所制备的short G蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性。本研究通过对G蛋白进行截短表达消除了ELISA检测IHNV时与VHSV存在交叉反应的问题,提高了IHNV免疫学检测的特异性,完善了IHNV的免疫学检测方法,该研究为我国现行IHNV的检测提供必要的物质基础,并且为防控IHNV亚单位疫苗的研制奠定了基础。

关键词：传染性造血器官坏死病毒糖蛋白原核表达抗血清免疫荧光检测

传染性造血器官坏死病毒G基因截短原核表达及其免疫原性研究

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传染性造血器官坏死病毒G基因截短原核表达及其免疫原性研究

作者：王艳雪东北农业大学

学位级别：硕士

传染性造血器官坏死（Infectious haematopoietic necrosis,IHN）是由弹状病毒科,粒外弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）感染引起的,可以感染所有的鲑科鱼类,是一种急性的具有高度... 详细信息

传染性造血器官坏死（Infectious haematopoietic necrosis,IHN）是由弹状病毒科,粒外弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）感染引起的,可以感染所有的鲑科鱼类,是一种急性的具有高度传染性的病毒性疾病,高致病力毒株对鲑鳟幼鱼的致死率达90%以上,该病现已成为世界性鲑鳟鱼病,给鲑鳟养殖业带来重大经济损失。但目前尚无治疗IHN的有效药物,疫苗仍是预防IHNV的最有效手段之一。IHNV的主要抗原蛋白是表面糖蛋白G,含有可诱导细胞产生免疫中和抗体的中和抗原表位。本实验利用生物信息学原理对其G蛋白基因序列进行信号肽区、疏水性跨膜区和抗原表位区的生物信息学分析IHNV HLJ-09株,利用大肠杆菌表达系统对G蛋白基因片段进行截短重组表达,分析表达蛋白的免疫原性和诱导虹鳟幼鱼免疫保护的效果。试验结果显示:1.构建了pET-28a-dG原核表达载体,经IPTG诱导后,获得53 kDa的目的蛋白。目的蛋白纯化后经Western blotting检测,目的蛋白可与鼠抗IHNV全病毒血清特异性识别,具有良好的免疫原性。2.利用纯化的目的蛋白（dG）制备鼠抗血清,经酶联免疫吸附试验检测该鼠抗血清均能与重组蛋白和IHNV HLJ-09株反应,其效价分别是1:25600和1:1600。利用制备的鼠抗血清进行了病毒中和试验测定,根据Reed-Muench氏法,得出其中和效价为1:112,说明该鼠抗血清能识别IHNV并能产生相应的中和抗体,具有一定的中和效应。3.为分析IHNV dG诱导虹鳟幼鱼的免疫保护效果,将纯化后的目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后接种虹鳟幼鱼,试验分为3组,即灭活疫苗组、重组蛋白组和PBS对照组,每尾2μg/g鱼体重的剂量进行腹腔注射。免疫后的第0、1、2、3、4、5、6周采集鱼血清,检测其特异性抗体IgM水平。结果显示,免疫后实验组鱼抗体水平显著提高（P＜0.01）,并且显著高于对照组（P＜0.01）,在免疫后的第四周达到高峰,随后下降。在免疫后的第四周进行攻毒保护试验结果显示,灭活疫苗组和重组蛋白组的相对保护率分别为62%和60%。以上结果表明,本研究利用大肠杆菌原核表达系统表达的截短IHNV G蛋白,能够作为IHNV亚单位疫苗的候选免疫原,可诱导虹鳟幼鱼产生中和抗体,抵抗IHNV的攻击,为进一步研究IHNV的亚单位疫苗奠定了一定理论基础。

关键词：传染性造血器官坏死病毒 G蛋白原核表达中和抗体免疫保护