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传染性支气管炎病毒反向遗传系统的构建策略与应用

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畜牧与兽医 2023年第10期55卷 109-115页

作者：赵秀美张华贾惠孙智远徐孝宙余智清姜逸江苏农林职业技术学院江苏镇江212400 江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)是一种具有高度传染性的禽冠状病毒,主要感染鸡的呼吸系统、肾脏和生殖系统等,是导致家禽产业经济损失的主要原因之一。IBV血清型和基因型众多,不同毒株之间交叉保护性差,疾病防... 详细信息

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)是一种具有高度传染性的禽冠状病毒,主要感染鸡的呼吸系统、肾脏和生殖系统等,是导致家禽产业经济损失的主要原因之一。IBV血清型和基因型众多,不同毒株之间交叉保护性差,疾病防控困难。IBV反向遗传系统的建立与应用为病毒分子水平研究、致病机制研究和新型疫苗研发等提供了新的途径。本文主要介绍了IBV反向遗传技术的构建策略,包括细菌人工染色体(载体)系统、体外连接系统、痘病毒载体系统和基于靶向RNA重组技术等,以及IBV反向遗传系统在病毒基因组结构和功能研究、新型疫苗研发和病毒表达载体研究等方面的应用,以期能为IBV的研究提供参考。

关键词：传染性支气管炎病毒反向遗传系统 S基因疫苗

传染性支气管炎病毒山西分离株的分离鉴定及其S1基因分子特征分析

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中国预防兽医学报 2022年第3期44卷 320-324页

作者：王旭贞程宇谭仕明马海利梁立滨山西省畜牧兽医学校山西太原030024 山西农业大学动物医学学院山西太谷030801

鸡传染性支气管炎(IB)是目前对养禽业造成严重危害的疫病之一,其病原为传染性支气管炎病毒(IBV)。IBV由于其基因组的特点而易于发生变异和重组,从而产生新的变异株。为了解山西地区IBV的流行及变异情况,本研究采集山西省晋中市疑似发生... 详细信息

鸡传染性支气管炎(IB)是目前对养禽业造成严重危害的疫病之一,其病原为传染性支气管炎病毒(IBV)。IBV由于其基因组的特点而易于发生变异和重组,从而产生新的变异株。为了解山西地区IBV的流行及变异情况,本研究采集山西省晋中市疑似发生呼吸道病毒感染的肉鸡组织病料样品,通过PCR鉴定、鸡胚接种及测序,分离鉴定到1株IBV,命名为CK/Shanxi-01/2021。在该分离株S1基因测序的基础上,与NCBI数据库中不同基因型IBV代表株进行序列比对,并构建系统进化树。遗传演化分析结果显示本研究所分离到的IBV为GI-19基因型。将CK/Shanxi-01/2021株的S1基因序列与IBV常用疫苗株H120、M41、H52、4/91及LDT3-A等进行序列比对分析,结果显示分离株与目前常用疫苗株核苷酸序列的同源性为78.1%~85.2%,氨基酸序列同源性为75.2%~78.4%,与以往GI-19基因型病毒株相比其S1蛋白高变区(HVR)出现了V68I、S120A、A271T、N282T、N291S等突变。由此可见,加强IBV流行病学监测,及时掌握目前流行的IBV基因型及其变异特点,对于IB疫情防控具有重要意义。本研究为山西省地区IB疫情防控提供了参考依据。

关键词：传染性支气管炎病毒分离鉴定 S1基因进化分析

传染性支气管炎病毒nsp4和nsp15通过调节NF-κB和IRF3信号通路抑制Ⅰ型干扰素表达

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中国兽医杂志 2021年第3期57卷 6-10,13页

作者：徐刚马淑慧天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津西青300392

为探究传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白在其抑制Ⅰ型干扰素表达作用中的机理,本试验利用IBV流行毒株感染原代鸡胚肾细胞,通过添加poly(I∶C),检测细胞中Ⅰ型干扰素的表达水平,并构建IBV流行毒株各非结构蛋白真核表达载体,转染鸡胚... 详细信息

为探究传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白在其抑制Ⅰ型干扰素表达作用中的机理,本试验利用IBV流行毒株感染原代鸡胚肾细胞,通过添加poly(I∶C),检测细胞中Ⅰ型干扰素的表达水平,并构建IBV流行毒株各非结构蛋白真核表达载体,转染鸡胚成纤维细胞(DF-1)后转染poly(I∶C),检测细胞中IFN-β、NF-κB以及IRF3的mRNA表达水平。结果显示,IBV JS株能显著抑制由poly(I∶C)诱导的I型干扰素的表达,且nsp3、nsp4、nsp7、nsp14以及nsp15在此过程中发挥重要作用,nsp4和nsp15可通过抑制上游信号通路中的NF-κB或IRF3的表达来抑制IFN-β的转录,拮抗I型干扰素反应。本试验结果可为深入研究IBV的致病机理及其逃避宿主免疫应答的机制提供理论基础。

关键词：传染性支气管炎病毒 Ⅰ型干扰素 nsp4 nsp15

传染性支气管炎病毒N蛋白广谱单克隆抗体的制备与鉴定

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中国家禽 2021年第5期43卷 27-32页

作者：杜旭彬赵佳郭梦娇李敏张成成吴艳涛张小荣扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏高校重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心江苏扬州225009

为制备能与多种基因型传染性支气管炎病毒(IBV)反应的广谱性单克隆抗体,反应谱能够覆盖当前在国内流行的主要优势基因型毒株。通过RT-PCR克隆了QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株N基因,分别插入原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6P-1构建了重组质... 详细信息

为制备能与多种基因型传染性支气管炎病毒(IBV)反应的广谱性单克隆抗体,反应谱能够覆盖当前在国内流行的主要优势基因型毒株。通过RT-PCR克隆了QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株N基因,分别插入原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6P-1构建了重组质粒pET-N和pGEX-N,并在大肠杆菌中进行原核表达,通过亲和纯化获得His-N和GST-N两种重组融合蛋白。用GST-N融合蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组蛋白His-N作为检测抗原建立间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。经过筛选和亚克隆,共获得12株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示8株单克隆抗体能与测试的所有基因型IBV发生特异性反应,另外4株可以与793B型4/91株以外的其他毒株发生反应。本研究成功获得了广谱性IBV单克隆抗体,为进一步研究建立通用性IBV抗原检测方法奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒 N蛋白单克隆抗体

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传染性支气管炎病毒中和表位研究进展

中国生物制品学杂志 2019年第2期32卷 233-237页

作者：李雯雯黄勇四川农业大学动物医学院四川成都611130

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)能引起急性、高度接触性传染病,严重危害全球家禽业。目前主要通过接种疫苗来控制该病,但效果不佳。中和表位能使中和抗体与相应抗原相互作用,中和抗体能抵御病毒感染、消除病毒并... 详细信息

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)能引起急性、高度接触性传染病,严重危害全球家禽业。目前主要通过接种疫苗来控制该病,但效果不佳。中和表位能使中和抗体与相应抗原相互作用,中和抗体能抵御病毒感染、消除病毒并防止病毒传播和扩散,在免疫中发挥重要的作用。因此鉴别出中和表位对预防和控制疾病以及有效疫苗和诊断试剂的发展十分重要。本文主要通过该病毒的四个结构蛋白来介绍其中和表位,以期对IBV中和表位的深入研究提供参考。

关键词：传染性支气管炎病毒结构蛋白中和表位疫苗

传染性支气管炎病毒受体及其纤突蛋白受体结合域研究进展

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动物医学进展 2019年第10期40卷 89-95页

作者：徐怀英刘星丽秦春芝王友令亓丽红张玉霞秦卓明山东省农业科学院家禽研究所山东济南250023 山东师范大学山东济南250014 山东省健牧生物药业有限公司山东济南250100

传染性支气管炎(IB)是一种由冠状病毒科γ属传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种高度接触性传染病,有多个临床致病型。位于冠状病毒囊膜上的纤突蛋白(S)是病毒组织嗜性和致病性的主要决定因素,S1蛋白上受体结合域(RBD)与宿主细胞受体的... 详细信息

传染性支气管炎(IB)是一种由冠状病毒科γ属传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种高度接触性传染病,有多个临床致病型。位于冠状病毒囊膜上的纤突蛋白(S)是病毒组织嗜性和致病性的主要决定因素,S1蛋白上受体结合域(RBD)与宿主细胞受体的结合是病毒感染的第一步,α和β属多种冠状病毒纤突蛋白(S)与宿主受体相互作用机制已研究得比较清楚,目前IBV受体及受体结合域是研究的热点。论文就近几年来IBV S蛋白的受体结合域、受体多样性、S1蛋白变异对RBD的影响及S2蛋白对IBV细胞嗜性的影响等方面研究进展进行综述,以期为揭示其致病机制,研制更有效的疫苗、抗病毒药物及诊断制剂等提供参考。

关键词：传染性支气管炎病毒 S蛋白受体受体结合域

传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选

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传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选

作者：李佳楠郑州大学

学位级别：硕士

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是家禽产业中具有高度传染性的一种病原体,易感染呼吸道,也可引起禽类肾脏和生殖道等疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。IBV变异率高且存在多种血清型,各血清型之间几乎没有交叉... 详细信息

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)是家禽产业中具有高度传染性的一种病原体,易感染呼吸道,也可引起禽类肾脏和生殖道等疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。IBV变异率高且存在多种血清型,各血清型之间几乎没有交叉保护作用,给IBV的诊断和治疗带来了巨大的挑战。S1蛋白作为主要的结构蛋白,负责病毒与宿主细胞膜的结合,能够引起机体产生中和性抗体。因此,抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)的制备和模拟表位的筛选,为IBV的检测打下基础,并为分析S1蛋白抗原表位提供参考。本研究将IBV M41毒株接种鸡胚进行扩繁,从而获得含有病毒的尿囊液。经提取病毒总RNA,RT-PCR方法扩增选定的S1基因,构建重组载体p ET-28a-S1并导入E.coli BL21(DE3)细胞中。诱导表达产物通过SDS-PAGE分析,重组S1蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 k Da。复性后的重组S1蛋白经Western-blot验证可以与鸡阳性血清发生反应,表明重组S1蛋白具有反应原性。将重组S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体的细胞株3D9。间接ELISA方法测定腹水抗体效价可达1:2.56×10,亲和常数为1.7×10L/mol。免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)结果显示单克隆抗体3D9可以与IBV M41毒株进行反应。以单克隆抗体3D9为靶标,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选。通过3轮淘选,对与单克隆抗体3D9特异结合的噬菌体进行测序、鉴定,最终获到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。本研究成功制备抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体,且可以与IBV M41毒株进行结合,并通过噬菌体展示技术最终筛选到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。

关键词：传染性支气管炎病毒 S1蛋白单克隆抗体噬菌体展示模拟表位

传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

作者：耿玥郑州大学

学位级别：硕士

传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血... 详细信息

传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血清型众多,不同的血清型之间缺乏交叉保护。IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的损失。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白,N基因具有高度的保守性。本研究以IBV N蛋白为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的预防、诊断及控制具有一定的意义。本实验将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,反转录为cDNA。设计一对特异性引物对N基因进行扩增,片段大小为1230bp,将其与克隆载体pMD19-T连接并转入DH5α感受态细胞并保存菌种,将其与表达载体pGEX-6p-1连接并转入Transetta（DE3）感受态细胞,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析重组N蛋白大小约为79kD,用GST柱纯化重组N蛋白,加入PreScission Protease切除GST标签,Western-blot检测N蛋白的抗原性,结果显示N蛋白有较好的抗原性。采用纯化的N蛋白对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,选取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过三轮亚克隆获得了13株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,其中8株能与IBV结合。选择效价高且能与IBV结合的1A12C5细胞株,通过小鼠体内诱生腹水法大量制备抗N蛋白的单克隆抗体,收集腹水用正辛酸-硫酸铵法对其进行纯化,SDS-PAGE电泳结果表明该单抗纯度比较高。1A12C5单克隆抗体重链为IgG2b,轻链κ型。纯化后的1A12C5单抗效价可以达到1:1.64×10~6,亲和力常数为1.87×10~7 L/mol。特异性鉴定结果表明1A12C5仅与IBV特异性结合。1A12C5单克隆抗体能与不同血清型的IBV反应。稳定性鉴定表明1A12C5单克隆抗体具有良好的传代稳定性。本试验成功制备了13株抗IBV N蛋白单克隆抗体其中8株可以与IBV结合,为进一步研制IBV诊断试剂奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp15的体外表达及其单克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2016年第1期46卷 52-57页

作者：李乐超石婷婷郎咸勇牟小东王丹丹周继勇廖敏浙江大学农业部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

以实验室保存的肾型传染性支气管炎病毒(IBV)毒株SC021202作为模板,扩增IBV非结构蛋白nsp15基因后,成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-nsp15,将其转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达出约45ku的目的蛋白。纯化的nsp15蛋白可与IBV感染鸡血清发... 详细信息

以实验室保存的肾型传染性支气管炎病毒(IBV)毒株SC021202作为模板,扩增IBV非结构蛋白nsp15基因后,成功构建了原核表达载体PET-28a(+)-nsp15,将其转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达出约45ku的目的蛋白。纯化的nsp15蛋白可与IBV感染鸡血清发生良好反应。用纯化的重组nsp15蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。经过3轮有限稀释和筛选阳性克隆,最终获得3株稳定分泌nsp15蛋白抗体的细胞株,分别为1A6、2B6和4D7。Western-blot分析显示,3株单克隆抗体都与nsp15蛋白有很好的特异性反应。IFA检测显示,nsp15单克隆抗体与IBV感染的细胞和nsp15基因转染的细胞均出现明显的反应。IBV nsp15单克隆抗体的制备为传染性支气管炎流行病学的监测、鉴别诊断及对其蛋白功能的进一步研究奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒非结构蛋白15 单克隆抗体