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高产C6-C10脂肪酸乙基酯酿酒酵母菌株的选育

高产C6-C10脂肪酸乙基酯酿酒酵母菌株的选育

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作者：陈艳芳天津科技大学

学位级别：硕士

C6-C10脂肪酸乙基酯(己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯)是白酒中重要的风味物质。己酸乙酯具有菠萝香气,辛酸乙酯具有苹果、菠萝和白兰地香味,癸酸乙酯具有椰子香气。虽然在酒类饮品中这些酯含量甚微,却使得风味更加饱满、口感更加醇厚。... 详细信息

C6-C10脂肪酸乙基酯(己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯)是白酒中重要的风味物质。己酸乙酯具有菠萝香气,辛酸乙酯具有苹果、菠萝和白兰地香味,癸酸乙酯具有椰子香气。虽然在酒类饮品中这些酯含量甚微,却使得风味更加饱满、口感更加醇厚。为了提高酿酒酵母合成C6-C10脂肪酸乙基酯的能力,本实验采用了ARTP诱变和基因工程改造的手段来提高发酵过程中酿酒酵母C6-C10脂肪酸乙基酯的生成量。(1)建立了ARTP-浅蓝菌素-传感器-玉米浓醪发酵验证筛选体系。利用该筛选模型从2000株菌的突变文库中筛选出33株传感器诱导倍数高于6的酿酒酵母菌株,通过玉米浓醪发酵结合GC-MS检测,进一步筛选获得15株C6-C10脂肪酸乙基酯产量提高的酿酒酵母菌株,其中菌株472产酯能力最强,三种酯的产量分别达到2.80mg/L,4.18 mg/L和9.78 mg/L,分别是出发菌的2.8倍,3.05倍和4.95倍。(2)建立了KS和MPT结构域的随机突变-传感器-玉米浓醪发酵验证筛选体系。根据已有研究的实验结果发现,提高C6-C10脂肪酸乙基酯的合成的正向突变位点主要集中在FAS1基因的MPT结构域以及FAS2基因的KS结构域上,结构域随机突变获得突变菌株,通过传感器检测和发酵验证筛选获得10株高产C6-C10脂肪酸乙基酯的菌株,其中M72产酯能力最强,三种酯的最高产量分别达到了3.23 mg/L、4.65 mg/L和6.47 mg/L,分别是出发菌的2.13倍、3.52倍和3.44倍。(3)FAS突变点的确定及点突变验证。对15株ARTP高产突变菌株的FAS基因测序得到未被报道的非同义突变点4个,分别是E171D、E172D、V1393W和A1735S。结合文献,构建了九种FAS点突变菌株,玉米浓醪发酵实验结果表明:E171D、E172D、A1735S三种氨基酸位点的突变有利于C6-C10脂肪酸乙基酯的合成。点突变菌株中:A1735S产酯能力最强。三种酯的产量分别达到了1.9 mg/L、3.65 mg/L和7.71mg/L。对十株产酯能力最强的MPT结构域随机突变菌株测序分析,发现了S318P、N390I、I407V、A424T和K441T五种未被报道过的非同义突变。初步推测非同义突变点对C6-C10脂肪酸乙基酯合成的促进作用:S318P>A424T>K441T。

关键词： C6-C10脂肪酸乙基酯 ARTP诱变传感器高通量筛选点突变 KS和MPT结构域脂肪酸合成酶复合体(FAS)

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