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丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备

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药学学报 2008年第7期43卷 766-772页

作者：高伟崔光红孔建强程克棣王伟袁媛黄璐琦中国中医科学院中药研究所北京100700 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhizacopalyl diphosphate synthase,SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化。结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4 mmol.L-1IPTG,在20℃诱导培养8 h表达的可溶性蛋白量最高,约占细胞总蛋白的35.6%。用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3 mg.L-1。将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1∶24 300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础。

关键词：丹参柯巴基焦磷酸合酶优化表达抗体制备

人乳头瘤病毒16型L2E7融合蛋白的优化表达、制备及其对肿瘤生长的抑制作用

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生物工程学报 2015年第4期31卷 566-576页

作者：姜云水李剑波高孟任皎金素凤陈刚吴洁庄昉成田厚文浙江省医学科学院病毒病研究所浙江省医学生物工程疫苗研究开发重点实验室浙江杭州310052 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

为提高人乳头瘤病毒(HPV)16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量,根据大肠杆菌偏爱密码子,对HPV16 l2e7基因进行密码子优化,优化后的基因分别插入到p GEX-5X-1、p QE30和p ET41a表达载体中,转化JM109、JM109(DE3)和BL21... 详细信息

为提高人乳头瘤病毒(HPV)16型治疗性融合蛋白疫苗HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达量,根据大肠杆菌偏爱密码子,对HPV16 l2e7基因进行密码子优化,优化后的基因分别插入到p GEX-5X-1、p QE30和p ET41a表达载体中,转化JM109、JM109(DE3)和BL21(DE3)表达菌,筛选出高表达菌株p ET41a-HPV16sl2e7/BL21(DE3),目的蛋白从占全菌蛋白的10%以下提高到约28%,优化接种量、IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,获得最佳表达条件;通过15 L发酵罐发酵,SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow和Superdex 200 pg纯化及复性HPV16 L2E7融合蛋白,制备的融合蛋白纯度可达95%以上,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定证实,制备的HPV16 L2E7蛋白加Cp G佐剂对小鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用,有75%(6/8)的小鼠不成瘤,为后续的疫苗产业化奠定基础。

关键词：人乳头瘤病毒16型优化表达发酵纯化宫颈癌疫苗

人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白在多形汉逊酵母中的优化表达

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生物工程学报 2009年第10期25卷 1516-1523页

作者：李巍巍何秀萍郭雪娜张振颖张博润中国科学院微生物研究所酵母菌分子遗传与育种实验室北京100101 中国科学院研究生院北京100049

为了实现人乳头瘤病毒(Humanpa pillomavirus,HPV)16亚型衣壳蛋白L1在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中的高效表达,根据L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性,对L1蛋白的编码序列进行优化设计,合成了完整的编码序列,命... 详细信息

为了实现人乳头瘤病毒(Humanpa pillomavirus,HPV)16亚型衣壳蛋白L1在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中的高效表达,根据L1蛋白的氨基酸序列及多形汉逊酵母的密码子偏爱性,对L1蛋白的编码序列进行优化设计,合成了完整的编码序列,命名为HPV16L1。以甲醇诱导型启动子MOXp和终止子AOXTT为表达调控元件,以尿嘧啶合成相关基因URA3为筛选标记,构建了HPV16L1的重组表达质粒pYMOXU-HPV16。用SacII酶切质粒pYMOXU-HPV16使其线性化,电转化多形汉逊酵母菌株H-ura3,依据营养缺陷互补筛选重组菌株。通过PCR扩增及HPV16L1蛋白表达量分析表明已获得稳定高表达L1蛋白的重组汉逊酵母菌株HP-U-16L。摇瓶发酵条件的初步优化表明,以YPM(pH7.0)为基础培养基进行诱导培养,控制接种量使初始培养液OD600为1.0,每隔12h补加甲醇至终浓度为1%(V/V),37oC、200r/min条件下诱导培养72h后,HPV16L1蛋白的最高表达量为78.6mg/L。本研究为多形汉逊酵母源HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

关键词：人乳头瘤病毒16亚型衣壳蛋白L1 多形汉逊酵母优化表达

在“梳理”中发现规律,在“探究”中优化表达——基于“个体语言经验”发展的语文园地教学探索

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小学语文教学 2023年第19期 49-52页

作者：尚卉江苏南京市百家湖小学

“梳理与探究”是2022年版课标提出的四种典型的语文实践活动之一。“梳理”,即梳爬整理,是根据所需,对学过的语文知识及方法技能进行自主分类、统计、排序等;“探究”,即探索追究,是对这些知识和方法技能进行“观察、聚焦、放大、比较... 详细信息

“梳理与探究”是2022年版课标提出的四种典型的语文实践活动之一。“梳理”,即梳爬整理,是根据所需,对学过的语文知识及方法技能进行自主分类、统计、排序等;“探究”,即探索追究,是对这些知识和方法技能进行“观察、聚焦、放大、比较、辩别、想象、预测、推理、判断”等。

关键词：语文实践活动语文知识方法技能语文园地优化表达教学探索个体语言梳理

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烯酮还原酶基因的克隆与优化表达

应用与环境生物学报 2011年第1期17卷 87-90页

作者：吕彤刘扬赵青任杰王敏吴洽庆朱敦明天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的... 详细信息

烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.***.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.

关键词：烯酮还原酶优化表达不对称还原 C=C双键丙酮丁醇梭菌

肝靶向干扰素(IFN-CSP)融合基因原核表达条件的优化

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生物医学工程学杂志 2014年第2期31卷 432-438页

作者：黄演婷卢雪梅汪洁金小宝朱家勇广东药学院药用生物活性物质研究所广东省生物活性药物研究重点实验室广州510006

本研究目的是优化肝靶向干扰素(IFN-CSP)在大肠杆菌中的诱导表达条件,以提高蛋白表达量。通过考查培养基pH值、诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间和起始菌浓度等五个因素对IFN-CSP融合基因原核表达量的影响,在此基础上,从上述影响因... 详细信息

本研究目的是优化肝靶向干扰素(IFN-CSP)在大肠杆菌中的诱导表达条件,以提高蛋白表达量。通过考查培养基pH值、诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间和起始菌浓度等五个因素对IFN-CSP融合基因原核表达量的影响,在此基础上,从上述影响因素中各选取4个水平进行正交实验作进一步分析。结果表明,起始菌浓度和诱导温度为影响表达的主要因素,最佳组合诱导条件为OD600为0.8时开始诱导、诱导4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L、培养基pH值为6.0,融合蛋白的表达量高达74.3%。通过表达优化后,IFN-CSP的产量为688.8mg/L,提高了1.2倍。这为进一步制定生产工艺和评价IFN-CSP的生物活性奠定基础。

关键词：肝靶向干扰素大肠杆菌优化表达正交设计实验

丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究

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中国中药杂志 2014年第7期39卷 1214-1219页

作者：刘玉忠申业荣齐仙吴文燕李瑞博吴志刚陈敏中国中医科学院中药资源中心北京100700

WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白，是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa，与... 详细信息

WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白，是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa，与预测的蛋白相对分子质量一样，说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化，结果表明在大肠杆菌BL21（DE3）中，当A600达到约1.0~1.5时，加入0.2 mol·L-1的IPTG，在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在，采用尿素提取包涵体蛋白，用Ni2＋亲和色谱法纯化表达蛋白，纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L-1。经蛋白质印迹检测，His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白，进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展 SmWRKY1 基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。

关键词：丹参 SmWRKY1 优化表达包涵体蛋白蛋白质印迹

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毕赤酵母优化表达外源蛋白策略

微生物学通报 2010年第7期37卷 1035-1042页

作者：余占桥马青山赵龙妹张日俊中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室北京100094

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种异源蛋白表达的理想系统,但目前并非所有的外源蛋白都能在毕赤酵母中成功高效表达,不同的蛋白表现为不同表达水平、生物活性及稳定性。从遗传因素和表达条件综述了外源蛋白在毕赤酵母中的优化... 详细信息

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种异源蛋白表达的理想系统,但目前并非所有的外源蛋白都能在毕赤酵母中成功高效表达,不同的蛋白表现为不同表达水平、生物活性及稳定性。从遗传因素和表达条件综述了外源蛋白在毕赤酵母中的优化表达策略。

关键词：毕赤酵母外源蛋白优化表达

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中的优化表达

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畜牧兽医学报 2014年第1期45卷 94-100页

作者：曾范利张云张梦时坤李建明刘菲李晶杜锐吉林农业大学中药材学院长春130118 吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 长春金赛药业有限责任公司长春130012 吉林农业大学研究生学院教育部动物生产及产品质量安全重点实验室吉林省药用动物二级实验室长春130118

为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1... 详细信息

为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1—345 aa、1—374 aa、45—297 aa、45—345 aa和45—374 aa,克隆至穿梭表达载体pMV361中,经酶切、PCR扩增和测序证实已正确插入到表达载体中,构建了6个原核表达质粒。阳性重组质粒通过电转化到卡介苗(BCG)感受态中,热诱导后,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹检测。结果表明6个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达,表达产物与理论推测的相对分子质量一致。Western blot结果显示其融合蛋白能被牛抗BVDV的阳性血清识别,具有相应的反应原性。本研究为进一步研究BVDV基因工程活载体疫苗奠定了基础。

关键词：牛病毒性腹泻-黏膜病病毒 E2基因卡介苗优化表达