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弓形虫复合抗原ROP2-SAG1优势表位与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1融合体的构建及其在真核细胞中的表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2018年第3期36卷 266-271页

作者：谢自新姜洁汪文寰吕金辉冯方方张丽芳李文姝温州医科大学药学院温州325032 温州医科大学微生物学与免疫学教研室温州325032 温州市人民医院妇产科学重点实验室温州325000

目的构建弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势表位(RSepitope)与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1(HPV16L1)的融合体(RSepitope-HPV16L1),验证其在真核细胞中的表达。方法优化RSepitope基因序列,构建pc DNA3.1/RSepitope重组真核表达质粒。... 详细信息

目的构建弓形虫复合抗原ROP2-SAG1免疫优势表位(RSepitope)与人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白L1(HPV16L1)的融合体(RSepitope-HPV16L1),验证其在真核细胞中的表达。方法优化RSepitope基因序列,构建pc DNA3.1/RSepitope重组真核表达质粒。从T-HPV16L1质粒中扩增HPV16L1基因片段,构建pc DNA3.1/RSepitope-HPV16L1重组质粒。双酶切、PCR、测序鉴定正确后,将2个重组质粒分别转染至非洲绿猴肾细胞COS-7细胞,培养48 h后收集细胞,提取RNA,RT-PCR扩增相应的目的基因。Western blotting和间接免疫荧光实验检测重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV16L1在细胞中的表达。结果构建的重组质粒pc DNA3.1/RSepitope和pc DNA3.1/RSepitope-HPV16L1经PCR扩增和双酶切分别获得282 bp和1 500 bp片段,与预期结果一致,测序结果正确。RT-PCR结果显示,以2个重组质粒转染细胞的c DNA为模板,分别扩增到282 bp和1 500 bp的目的条带。Western blotting分析结果显示,以RSepitope免疫血清为一抗,重组蛋白RSepitope和RSepitope-HPV16L1分别在相对分子质量(Mr)约为10 000和65 000处出现特异性条带;以HPV16L1单克隆抗体为一抗,重组蛋白RSepitope-HPV16L1在Mr65 000处出现特异性条带。间接免疫荧光实验结果显示,以RSepitope免疫血清为一抗,重组质粒pc DNA3.1/RSepitope和pc DNA3.1/RSepitope-HPV16L1转染细胞内均观察到绿色荧光;以HPV16L1单克隆抗体为一抗,重组质粒pc DNA3.1/RSepitope-HPV16L1转染细胞内观察到特异性绿色荧光。结论弓形虫优势表位RSepitope与HPV16L1融合体构建成功,且可在真核细胞中表达。

关键词：弓形虫优势表位人乳头瘤病毒16型晚期结构蛋白表达

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抗原优势表位的筛选方法

中国病原生物学杂志 2012年第1期7卷 78-80,55页

作者：李玉娇朱玥洁杨晶丁剑冰新疆医科大学基础医学院新疆乌鲁木齐830011 新疆医科大学第一附属医院骨科新疆乌鲁木齐830011

疫苗的出现有效降低了人类感染性疾病的发病率和死亡率。随着科学的进步和发展,发现原始的疫苗已经不能满足当今社会的需要。现代保护性免疫理论认为,有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。近年来兴起的表位研制技术,是用... 详细信息

疫苗的出现有效降低了人类感染性疾病的发病率和死亡率。随着科学的进步和发展,发现原始的疫苗已经不能满足当今社会的需要。现代保护性免疫理论认为,有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。近年来兴起的表位研制技术,是用抗原表位制备疫苗,它在感染性疾病和恶性肿瘤中有着自身独特的优势。因此如何在众多的表位中确定优势表位,已经成为研究的新方向。本文详细阐述了优势表位的筛选办法,对其最新的研究进展进行了综述。

关键词：抗原优势表位研究进展综述

以乙肝病毒核心蛋白为载体的脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及其免疫效果研究

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以乙肝病毒核心蛋白为载体的脑膜炎奈瑟菌表位疫苗的构建及其免疫...

作者：曹惠南华大学

学位级别：硕士

[目的]将利用生物信息学软件筛选的B群脑膜炎奈瑟菌MC58菌株表面蛋白A（Neisseria surface protein A,NspA）的优势表位肽,与截短的HBc-N144融合,探究构建的重组表位疫苗HBc-N144-epitope（1+2）通过肌注和滴鼻途径免疫雌性BALB/c小鼠... 详细信息

[目的]将利用生物信息学软件筛选的B群脑膜炎奈瑟菌MC58菌株表面蛋白A（Neisseria surface protein A,NspA）的优势表位肽,与截短的HBc-N144融合,探究构建的重组表位疫苗HBc-N144-epitope（1+2）通过肌注和滴鼻途径免疫雌性BALB/c小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,尤其是黏膜免疫应答水平及其免疫保护效果,为寻找NspA的功能性抗原表位、研制高效B群流脑表位疫苗提供相关实验依据。[方法]1.构建HBc-N144-epitope（1+2）重组原核表达质粒。通过NCBI查找GenBank中的脑膜炎奈瑟菌MC58标准株,获取NspA的基因序列,运用生物信息学软件预测和筛选NspA的优势抗原片段。将预测的表位的碱基序列插入到截短的乙肝核心蛋白（HBc-N144）免疫显性区域（MIR）的78-79位氨基酸所对应的的碱基序列之间,获得测序正确的重组原核表达质粒pET28a-HBc-N144-epitope（1+2）。2.制备HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗。扩大培养含有pET-28a-HBc-N144-epitope（1+2）融合质粒的*** BL21菌株,诱导表达重组蛋白后经镍柱亲和层析纯化,采用Western Blot法对HBc-N144-epitope（1+2）的表达进行鉴定,并通过透射电镜检测病毒样颗粒的形成。3.评价HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗的免疫效果。将纯化后的重组蛋白HBc-N144-epitope（1+2）,通过肌注和滴鼻途径免疫3周龄的雌性BALB/C小鼠,采用间接ELISA法检测血清中特异性I gG及其亚类以及生殖道分泌物和肺泡灌洗液中sIgA抗体水平。分离培养小鼠脾淋巴细胞,双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清中IL-4、IFN-γ和IL-17A水平;流式细胞术分析脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞亚群。末次免疫两周后,制备致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58菌液,进行小鼠攻击实验,记录HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗的免疫保护率。使用人源补体,进行血清体外杀菌试验,检测免疫小鼠血清抗体的体外杀菌活性。4.观察疫苗接种部位炎症细胞浸润情况。采集肌注组中小鼠接种部位的肌肉组织、滴鼻组小鼠肺组织作H＆E染色,分析各蛋白免疫组相应组织的炎性浸润情况。[结果]1.成功构建了HBc-N144-epitope（1+2）病毒样颗粒表位疫苗。经透射电镜检测构建的HBc-N144-epitope（1+2）表位疫苗形成直径为30nm左右的颗粒样结构;***-N144-epitope（1+2）表位疫苗通过肌注和滴鼻途径免疫小鼠后,能够诱导小鼠产生抗NspA的特异性抗体,并且随着免疫次数增加,抗体水平呈上升趋势。（1）经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组小鼠血清特异性IgG水平明显高于NspA组、HBc-N144组和PBS组（p＜0.05）;HBc-N144-epitope（1+2）和HBc-N144-NspA组之间无显著差异（p＞0.05）。HBc-N144-epitope（1+2）组、HBc-N144-NspA组和NspA组的特异性IgG1/IgG2a比值均大于1。（2）经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组小鼠生殖道分泌液和肺泡灌洗液中特异性sIgA水平明显高于HBc-N144和PBS组（p＜0.01）,其中HBc-N144-epitope（1+2）组明显高于NspA组（p＜0.05）,而HBc-N144-epitope（1+2）和HBc-N144-NspA组之间相比较无显著性差异（p＞0.05）。（3）流式细胞术检测结果显示肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epito pe（1+2）、HBc-N144-NspA和NspA组诱导的免疫应答均倾向于Th2型。ELISA试剂盒定量检测免疫小鼠脾细胞上清中细胞因子结果显示,经肌注和滴鼻免疫的HBc-N144-epitope（1+2）组和HBc-N144-NspA组脾细胞上清中产生的IL-4、IFN-γ、IL-17A含量均高于Nsp A组（p＜0.05）,而两组之间相比较无明显差异（p＞0.05）。***-N144-epitope（1+2）表位疫苗具有较好的免疫保护效果:（1）免疫小鼠存活率。肌注法:HBc-N144-epitope（1+2）、HBcN144-NspA和NspA组在致死剂量的脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72h内的存活率分别为90%、90%和80%;HBc-N144和PBS组在48h内的存活率均为0。滴鼻法:HBc-N144-epitope（1+2）、HBc-N144-Nsp A和NspA组在72h内的存活率

关键词： B群脑膜炎奈瑟菌奈瑟菌表面蛋白A 优势表位乙肝病毒核心蛋白重组表位疫苗

兼职蛋白热休克蛋白70与α-烯醇酶的人B细胞表位肽预测及其瓜氨酸化的血清学检定

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微生物学免疫学进展 2021年第3期49卷 5-13页

作者：李虹颖张鑫王文静李陈铎夏思思吕喆陈彦孙英袁慧慧王炜首都医科大学基础医学院免疫学系北京100069 首都医科大学附属佑安医院临床检验中心北京100069 首都医科大学附属北京朝阳医院风湿免疫科北京100020

目的筛选与自身免疫病相关兼职蛋白的B细胞优势表位肽并进行血清学检定。方法利用DNAMAN软件分析不同物种热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和α-烯醇酶氨基酸序列同源性,IEDB数据库和瓜氨酸化在线平台预测线性B细胞表位和瓜... 详细信息

目的筛选与自身免疫病相关兼职蛋白的B细胞优势表位肽并进行血清学检定。方法利用DNAMAN软件分析不同物种热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和α-烯醇酶氨基酸序列同源性,IEDB数据库和瓜氨酸化在线平台预测线性B细胞表位和瓜氨酸化修饰位点;间接ELISA检测抗HSP70和α-烯醇酶蛋白瓜氨酸化前后表位肽抗体。结果同源性分析和IEDB数据库预测得到兼职蛋白HSP70和α-烯醇酶各10个B细胞优势表位肽;瓜氨酸化位点预测显示,其分别有9个和4个位点可能会发生瓜氨酸化修饰,其中5个瓜氨酸化修饰位点与预测表位肽重合。与正常人相比,抗环瓜氨酸肽抗体阳性患者血清抗瓜氨酸化修饰表位肽的抗体滴度明显增高(P优势表位肽。

关键词：兼职蛋白热休克蛋白烯醇化酶瓜氨酸化优势表位

丙肝和梅毒抗体的灰区标本假阳性结果分析及梅毒抗体检测方法改进的研究

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丙肝和梅毒抗体的灰区标本假阳性结果分析及梅毒抗体检测方法改进...

作者：杜丽枝广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景丙型肝炎和梅毒是常见血液传播性疾病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染可造成急性或慢性肝炎,会发展为肝硬化或肝癌。梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)感染可损害人体多系统多器官,导致组织破坏、功能丧失,甚至危... 详细信息

研究背景丙型肝炎和梅毒是常见血液传播性疾病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染可造成急性或慢性肝炎,会发展为肝硬化或肝癌。梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)感染可损害人体多系统多器官,导致组织破坏、功能丧失,甚至危及生命,并能母婴传播,威胁下一代健康。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,丙肝和梅毒发病率呈逐年上升趋势,现已成为严重的公共卫生问题。目前尚无能预防HCV和TP感染的有效疫苗。这两种疾病感染初期往往无明显的临床症状和体征,易造成漏诊,延迟治疗。实验室结果作为主要临床诊断指标,结果准确对临床诊疗与阻断疾病的传播具有重要意义。近年来,酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)因其通量大、自动化程度高、易于标准化等优点,已广泛应用于无症状人群的筛查和疾病诊断。但许多研究表明,ELIA和CLIA两种筛查试验均存在一定比例的假阳性,尤其在低感染流行人群中会出现较高的假阳性。假阳性结果会带给受检者不必要的就医和心理伤害,需要引起重视。影响产生假阳性的因素目前尚不明确。不同检测方法的假阳性率不同,这可能与方法使用的反应体系、抗原成分和抗原表位等有关。TP47蛋白是梅毒螺旋体中丰度最高、抗原性强和特异性高的抗原,是用于检测梅毒特异性抗体的主要抗原之一。研究报道,TP47中有一段与人纤维连接蛋白有较高的同源性的序列,这可能和某些自身免疫性病人血清与梅毒检测试剂发生交叉反应有关。利用生物信息学技术预测特异性抗原表位,去掉特异性差的片段,降低引起交叉反应的可能性。这种抗原表位的应用可能会降低假阳性反应,提高检测方法的特异性。研究目的1.探讨Architect i2000和HISCL 5000两种化学发光方法检测抗HCV抗体(Hepatitis C virus antibody,Anti-HCV)和抗TP抗体(Treponema Pallidum antibody,Anti-TP)灰区标本的假阳性结果情况,为HCV和TP的诊断和治疗提供应用参考。2.建立TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的双抗原夹心ELISA,比较两方法检测梅毒抗体的敏感性和特异性,探索利用抗原表位解决假阳性问题方案的可行性。研究方法1.收集本院Architect i2000检测Anti-HCV筛查阳性结果(1≤S/CO≤5)的样本161例。全部样本均进行HISCL 5000检测。以高敏HCV核酸(Ribonucleic acid,RNA)定量和重组免疫印迹试验(Recombinant immune blot assay,RIBA)的结果为标准确定真、假阳性。采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。P表位预测。根据上述预测软件的结果,选取TP47的81-120的氨基酸序列作为优势抗原表位,应用基因工程技术,构建原核表达载体pET28b-TP47E,重组质粒经酶切和测序鉴定,并转化至*** BL21中,IPTG诱导表达、镍离子亲和层析柱纯化和免疫印迹法(Western Blot,WB)鉴定。4.采用过碘酸钠法标记重组蛋白作酶标抗原,以重组蛋白作包被抗原,建立双抗原夹心ELISA,优化抗原包被浓度、包被方式、封闭条件、血清稀释倍数、血清反应时间、酶标抗原浓度、酶标抗原反应时间和底物反应时间等条件,并检测46份TPPA阴性血清和91份Architect i2000检测结果处于灰区的标本(1≤S/CO≤10),比较TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的双抗原夹心ELISA的敏感性和特异性。研究结果***检测Anti-HCV结果阳性的标本有23例,阴性的有138例,两化学发光法的Anti-HCV结果一致率为14.3%(23/161)。所有标本的HCV RNA定量检测结果均阴性。RIBA检测13例结果阳性,45例不确定,103例

关键词：丙型肝炎抗体梅毒抗体灰区标本假阳性优势表位 TP47

HPV16 L2肽段疫苗的构建及免疫学功能研究

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中国妇幼健康研究 2009年第3期20卷 256-258页

作者：徐海燕李英辉蔡国青龚照鲁瑶辛晓燕第四军医大学西京医院妇产科陕西西安710032

目的探讨基于人乳头瘤病毒16次要衣壳蛋白L2抗原优势表位多倍复制重组多肽疫苗的构建与诱导免疫应答之间的关系。方法采用芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成多肽，用高效液相色谱分析多肽的纯度，对所合成的多肽采用质谱进行定性鉴定。... 详细信息

目的探讨基于人乳头瘤病毒16次要衣壳蛋白L2抗原优势表位多倍复制重组多肽疫苗的构建与诱导免疫应答之间的关系。方法采用芴甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成多肽，用高效液相色谱分析多肽的纯度，对所合成的多肽采用质谱进行定性鉴定。通过淋巴细胞增殖试验、细胞毒性杀伤试验及酶联免疫吸附试验方法研究该疫苗激发的细胞免疫及反应强度。结果合成的多肽经纯化后纯度均达到95％以上，经质谱分析，各肽的分子量测定值与理论值相符。所设计的多肽疫苗免疫小鼠后，小鼠淋巴细胞体外培养增殖明显，并可特异性地在体外杀伤小鼠肺上皮细胞，小鼠血清体外可诱导较高的干扰素-γ。结论在多肽疫苗的设计中，多倍复制重组人乳头瘤病毒次要衣壳蛋白L2肽段优势表位可增强疫苗的免疫原性，为进一步研制开发宫颈癌疫苗打下了基础。

关键词：子宫颈癌人乳头瘤病毒16 次要衣壳蛋白L2 优势表位多肽疫苗