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生物医学工程学杂志 2013年第4期30卷 817-821页

作者：邓仪昊何红云张本斯大理学院基础医学院人体解剖学教研室大理671000

为获取针对休眠期结核分枝杆菌(MTB)疫苗,本研究以编码MTB休眠相关转录调节蛋白DosR的基因Rv3133c为靶基因构建重组卡介苗,并研究其免疫效应。在本研究中,将从结核分枝杆菌H37Rv基因组获取的Rv3133c插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pM... 详细信息

为获取针对休眠期结核分枝杆菌(MTB)疫苗,本研究以编码MTB休眠相关转录调节蛋白DosR的基因Rv3133c为靶基因构建重组卡介苗,并研究其免疫效应。在本研究中,将从结核分枝杆菌H37Rv基因组获取的Rv3133c插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361构建重组质粒,该重组体以电转化方式导入卡介苗基因组构建重组卡介苗rBCG-Rv3133c。将成功构建的重组卡介苗免疫BALB/c小鼠,分别在免疫后30d及180d,通过检测疫苗诱导的血清抗体滴度水平评价其诱导的体液免疫反应,通过检测免疫小鼠脾淋巴细胞受TB-PPD刺激后脾CD4+和CD8+T细胞的比例变化、细胞因子IFN-γ的表达评价重组疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,重组疫苗rB-CG-Rv3133c可诱导产生较BCG更高水平的特异性抗体滴度、更强的CD4+和CD8+T细胞增殖反应及较高水平的IFN-γ表达量,提示该疫苗具有较强的研究应用价值。

关键词：休眠结核分枝杆菌 Rv3133c 重组卡介苗免疫效应

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磁珠固定靶蛋白预富集联合迭代筛选发现混合物中微量活性配体

磁珠固定靶蛋白预富集联合迭代筛选发现混合物中微量活性配体

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作者：段昌园重庆医科大学

学位级别：硕士

天然产物活性成分往往含量很低,现有天然产物筛选方法对于微量活性成分的发现效率有限。磁珠固定化酶具有稳定性强、重复性好、易于分离等特点,已广泛应用于天然产物的活性成分筛选。结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tubercul... 详细信息

天然产物活性成分往往含量很低,现有天然产物筛选方法对于微量活性成分的发现效率有限。磁珠固定化酶具有稳定性强、重复性好、易于分离等特点,已广泛应用于天然产物的活性成分筛选。结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL)是休眠结核菌乙醛酸循环必须酶,是清除休眠结核菌关键靶之一。本课题组前期建立的基于磁珠固定靶蛋白迭代筛选(Affinity Driven Exponential Enrichment,ADEE)方法,及快速分批结合预富集偶联迭代筛选(Affinity Driven Pre-enrichment and Exponential Enrichment,ADPEE),初步证明可应用于组合合成小库的高亲和力配体发现。本文基于多种磁珠固定靶蛋白,优化ADPEE,并应用于探索天然产物中以Mt ICL靶为主的未知高亲和力配体的富集和发现。重组表达N端6×His标签的Mt ICL,并选用MSP-COOH-F1和MSP-NTA两种表面修饰偶极离子的亲水磁珠固定化Mt ICL并考察两种磁珠的固定化容量、保留酶活和稳定性等。优选羧基磁珠并优化固定化体系用于后续筛选工作。利用Discovery Studio(DS)2019虚拟筛选,发现结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mt DHFR)、Mt ICL的新型有效抑制剂。以Mt DHFR与甲氨蝶呤复合物晶体(PDB:1DF7)、Mt ICL与三溴丙酮酸复合物晶体(PDB:1F8M)提取靶蛋白结构和活性中心,用于天然产物库SELLECK和TCMSP筛选。通过对接、打分、相互作用力分析以及ADMET计算,获得苗头化合物结构。经活性验证,S5145(Protoporphyrin,原卟啉)对Mt DHFR的IC为0.29±0.24μmol/L(n=3),抗***的MIC值为175.8μg/m L;MOL005118(Daphetin,瑞香素)对Mt ICL的IC为4.43±0.37μg/m L(≈24.38±0.37μmol/L,n=3),抗***的MIC值为128μg/m L。原卟啉、瑞香素分别来自鸡蛋壳(褐色素)和祖师麻,后续可选用这两种天然产物进行ADPEE筛选验证。ADPEE是重复快速结合并分离的预富集偶联迭代筛选方法。理论推测其预富集过程为动力学控制过程,故设计以结合时间为变量的实验考察ADPEE预富集可能机制。结果显示,快速结合时间越短,预富集选择性越高,高亲和力配体预富集绝对量更高,初步说明此过程为动力学非平衡结合过程;相较于ADEE,在3 min快速结合预富集条件下,ADPEE筛选目标配体相对于参考配体的累积富集效率比明显优于ADEE累积富集效率比;筛选体积较小且蛋白损耗量相对较低,操作更简便,但绝对富集量相对于ADEE有所降低。可见相对于ADEE,ADPEE选择性更高。因此,ADPEE富集混合物中微量高亲和力配体的综合效能更高,对天然产物中微量活性成分的筛选ADPEE将具有更强实用性。应用ADPEE,探索不同靶蛋白的天然产物筛选。针对Mt DHFR,经中药提取物活性初筛,选择北沙参、生地黄和熟地黄用ADPEE筛选,被富集成分未在数据库中搜索到相应分子量目标结构,有待纯化分离后鉴定;针对Mt ICL,选择祖师麻制备醇提物,瑞香素经ADPEE有效富集。综上所述,通过比较两种不同亲水磁珠对靶蛋白Mt ICL的固定化方案,MSP-COOH-F1对靶蛋白的固定化效果最优;虚拟筛选首次发现Mt ICL潜在高亲和力抑制剂瑞香素;通过实验设计进一步明确ADPEE预富集的动力学控制过程;以Mt DHFR为靶蛋白,通过实验比较发现ADPEE相对富集效率是ADEE的～1.3倍,明确ADPEE可能是天然产物的筛选的更实用方案。

关键词：结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶休眠结核分枝杆菌虚拟筛选快速非平衡结合联合迭代筛选天然产物

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