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代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2024年第08期 2432-2443页

作者：姚卓越李然蒋帅吴鹤云马倩谢希贤天津科技大学生物工程学院天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的... 详细信息

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的工程菌株。首先，依次敲除deoA、tdk、udp、rihA、rihB、rihC基因，以阻断胸苷的分解途径和补救途径；随后，引入来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)F126的嘧啶核苷操纵子基因，以增强前体物尿苷酸合成途径代谢通量；最后，依次优化胸苷合成途径中尿苷酸激酶、核糖核苷二磷酸还原酶、胸苷酸合酶和5′-核苷酸酶的表达，以强化尿苷至胸苷合成途径代谢通量。所构建的THY6-2工程菌株在5 L分批补料发酵试验中胸苷产量为11.10g/L、转化率为0.04g/g葡萄糖、生产强度为0.23g/(L·h)。本研究构建了以葡萄糖为唯一碳源且不携带质粒的高效合成胸苷工程菌株，为其他嘧啶核苷类产品的研发提供了借鉴。

关键词：胸苷大肠杆菌代谢工程从头合成途径

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生物合成天然2-苯乙醇细菌的筛选及合成途径分析

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食品科学 2021年第16期42卷 69-75页

作者：荣绍丰伍进管世敏蔡宝国张硕李茜茜上海应用技术大学香料香精技术与工程学院上海201418

从上海国家森林公园土壤样本中筛选到1株菌株,经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌属肠杆菌属并命名为Enterobacter ***024。Enterobacter ***024全基因组测序结果表明该菌株包含从头合成途径和艾氏途径合成2-苯乙醇所有关键酶的... 详细信息

从上海国家森林公园土壤样本中筛选到1株菌株,经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌属肠杆菌属并命名为Enterobacter ***024。Enterobacter ***024全基因组测序结果表明该菌株包含从头合成途径和艾氏途径合成2-苯乙醇所有关键酶的编码基因。分别以葡萄糖、L-苯丙氨酸为底物进行生物转化实验,并以苯乙醛、苯丙酮酸等合成途径中间产物为底物进行验证,气相色谱-质谱法、红外光谱分析结果进一步说明Enterobacter ***024具备两种2-苯乙醇合成途径,且该菌利用从头合成途径和艾氏途径产2-苯乙醇产量分别达到0.56、1.15 g/L。该菌株以葡萄糖为碳源生物合成2-苯乙醇极具应用前景。

关键词：肠杆菌 2-苯乙醇艾氏途径从头合成途径

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利用蔗糖产尿苷二磷酸葡萄糖的大肠杆菌构建

食品与发酵工业 2023年第22期49卷 9-18页

作者：姚睿赵丽婷陈磊李由然顾正华石贵阳丁重阳江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDP-glucose)不仅是细胞壁合成的前体物质,也是多种糖供体的重要前体物质。代谢工程可赋予微生物利用廉价易获得的原料生产特定化学物质的能力。该研究采用代谢工程技术改造大肠杆菌(Esch... 详细信息

尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDP-glucose)不仅是细胞壁合成的前体物质,也是多种糖供体的重要前体物质。代谢工程可赋予微生物利用廉价易获得的原料生产特定化学物质的能力。该研究采用代谢工程技术改造大肠杆菌(Escherichia coli)蔗糖利用和UDP-葡萄糖合成的代谢路径,在*** BL21(DE3)中以蔗糖为唯一碳源,在实现细胞生长的同时促进UDP-葡萄糖的生产。通过在*** BL21(DE3)中共表达蔗糖通透酶基因(cscB)、果糖激酶基因(cscK)、蔗糖合酶基因(susy),确定了高拷贝数质粒(pMD19-T)和启动子串联策略(P_(csc)-P_(T7))是合成UDP-葡萄糖的最优策略,成功构建了能够利用蔗糖产UDP-葡萄糖的工程菌株ESBK09。此外,为了进一步增加菌株的稳定性,将cscB基因整合到*** BL21(DE3)基因组中构建工程菌株EPT03,该菌株被证明能够利用蔗糖生产UDP-葡萄糖。构建具有蔗糖利用能力的工业菌株将促进蔗糖作为碳源的使用,有助于石油化工经济向生物经济的过渡,为今后利用UDP-葡萄糖生产葡萄糖基化生物分子提供通用性底盘微生物菌株,也为后续利用UDP-葡萄糖合成相关大分子物质的代谢网络的构建提供了关键的一环。

关键词：代谢工程大肠杆菌 UDP-葡萄糖蔗糖合酶从头合成途径

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高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

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食品与发酵工业 2016年第11期42卷 14-19页

作者：王鸿超张陈周昕陈海琴顾震南张灏陈卫陈永泉江南大学食品学院江苏无锡214122

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中... 详细信息

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。

关键词：功能鉴定从头合成途径 GDP-甘露糖-4,6-脱水酶 GDP-L-岩藻糖高山被孢霉

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FAA1基因敲除酵母菌株的构建与发酵研究

FAA1基因敲除酵母菌株的构建与发酵研究

作者：崔吉晓天津科技大学

学位级别：硕士

酯类物质可以在啤酒中提供“果香”气味,是一类关键的气味物质。酯类物质的多少决定了啤酒质量的高低,在啤酒含有的众多酯类物质中中链脂肪酸乙酯是啤酒良好风味的主要贡献者,是啤酒香气的重要载体,主要包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙... 详细信息

酯类物质可以在啤酒中提供“果香”气味,是一类关键的气味物质。酯类物质的多少决定了啤酒质量的高低,在啤酒含有的众多酯类物质中中链脂肪酸乙酯是啤酒良好风味的主要贡献者,是啤酒香气的重要载体,主要包括己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯,其中己酸乙酯带有清新的茴香香气,而辛酸乙酯则带有清甜的苹果香气,癸酸乙酯有玫瑰花香。酯类在酵母中主要通过从头合成途径生成,该途径是以葡萄糖为出发点经糖代谢途径转化为乙酰辅酶A,在羧化酶和醇酰基转移酶的作用下由对应的醇与酰基辅酶A合成酯,该途径生成中链脂肪酸乙酯受乙酰辅酶A羧化酶含量影响。本论文研究了酿酒酵母中长链饱和脂肪酸酰基辅酶A合成酶(fatty acyl-Co A synthetase)编码基因FAA1的表达量对于中链脂肪酸乙酯产量的影响,FAA1基因编码的长链饱和脂肪酸酰基辅酶A合成酶主要负责吸收外源长链脂肪酸并将其转化为酰基Co A。酵母中长链酰基Co A合成酶会对乙酰Co A羧化酶产生负反馈抑制,长链酰基Co A合成酶的含量越高,乙酰Co A羧化酶的含量越低,从而导致中链脂肪酸乙酯乙酯产量降低。本文选取工业啤酒酵母菌株TCCC 31194为研究对象,探究FAA1(Sc FAA1、Seub FAA1)基因的敲除对酿酒酵母啤酒发酵能力的影响。构建了基因单敲除菌株FAA1ΔX和FAA1ΔY,以及基因双敲除菌株FAA1ΔXΔY。分别对其进行酵母发酵验证后结果表明,Sc FAA1和Seub FAA1基因的敲除对啤酒酵母的发酵能力并无显著的影响,但敲除Seub FAA1基因的菌株在发酵前期酵母数量有明显提高,啤酒中糖的代谢速率随之增加。发酵结果表明,Sc FAA1和Seub FAA1基因的敲除对于啤酒中芳香醇的含量没有影响。而基因双敲除菌株FAA1ΔXΔY的发酵结果表明,双敲除后会影响菌株中链脂肪酸乙酯的代谢,啤酒发酵液中的C6-C10脂肪酸乙酯如己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量均有所提高,分别为56.23%、47.12%、26.34%。而乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别提高了32.37%、49.25%。这是由于敲除FAA1基因解除长链酰基Co A合成酶对乙酰Co A羧化酶的负反馈抑制,从而提高了中链脂肪酸乙酯的产量。

关键词：啤酒酵母从头合成途径 FAA1 中链脂肪酸乙酯基因敲除

鞘脂代谢酶3-酮二氢鞘氨醇还原酶的结构与功能研究

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鞘脂代谢酶3-酮二氢鞘氨醇还原酶的结构与功能研究

作者：赵亚楠天津大学

学位级别：硕士

鞘脂(sphingolipid)是生物细胞中最主要的膜脂之一,同时也作为信号分子介导细胞生长、增殖、迁移和死亡等重要的生理反应,异常鞘脂代谢经常与皮肤病、心血管疾病、癌症以及神经变性病相关。鞘脂种类繁多且功能各异,主要通过从头合成途... 详细信息

鞘脂(sphingolipid)是生物细胞中最主要的膜脂之一,同时也作为信号分子介导细胞生长、增殖、迁移和死亡等重要的生理反应,异常鞘脂代谢经常与皮肤病、心血管疾病、癌症以及神经变性病相关。鞘脂种类繁多且功能各异,主要通过从头合成途径和补救合成途径产生。3-酮二氢鞘氨醇还原酶(3-keto-dihydrosphingosine reductase,KDSR)是鞘脂从头合成途径中的关键酶,将3-酮二氢鞘氨醇催化还原为二氢鞘氨醇,在鞘脂代谢和稳态调节方面发挥重要作用。KDSR是定位在内质网的三次跨膜蛋白质,具有短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenases/reductase,SDR)家族的典型特征。目前已知KDSR突变后会导致渐进性对称红斑角化病和鱼鳞病等皮肤病,此外还与血小板减少症、肝损伤以及白血病密切相关。本文主要从蛋白质结构层面对KDSR展开研究,并运用分子生物学、生物化学和结构生物学等手段探索其作用机制以及致病机理。首先在大肠杆菌原核表达系统中获得位于KDSR二聚体界面的三种致病突变体(KDSR、KDSR和KDSR)的蛋白质并进行晶体学研究,解析了KDSR和KDSR的高分辨率三维结构,并比较分析了它们与野生型之间的局部结构差异。此外还通过SAXS实验验证并比较了野生型和致病突变体蛋白质的聚合状态和构象差异,同时本论文还进行了体外酶活鉴定实验表征了致病突变体可导致KDSR失去催化能力。总之,本研究在蛋白质三维结构层面初步提出KDSR突变体致病性的分子基础,为后续深入研究该酶的催化机制和致病机理提供参考价值,同时也为今后的功能研究和药物研发奠定良好的基础。

关键词：鞘脂代谢从头合成途径 3-酮二氢鞘氨醇还原酶晶体结构病理突变

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代谢工程改造大肠杆菌生产胞苷5'-单磷酸

代谢工程改造大肠杆菌生产胞苷5'-单磷酸

作者：董田田江南大学

学位级别：硕士

胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)是制备多种核苷酸衍生物的关键中间体,广泛应用于食品和制药行业。随着抗病毒、抗肿瘤等药物研发的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不断拓展,嘧啶核苷的市场需求不断扩大,迫切需要开发廉价的可规模化应用的嘧啶核... 详细信息

胞苷5’-单磷酸(5’-CMP)是制备多种核苷酸衍生物的关键中间体,广泛应用于食品和制药行业。随着抗病毒、抗肿瘤等药物研发的深入以及嘧啶核苷功能性研究的不断拓展,嘧啶核苷的市场需求不断扩大,迫切需要开发廉价的可规模化应用的嘧啶核苷生产工艺。传统生产5’-CMP的方法主要包括核酸水解法和化学合成法。但是因核酸水解法和化学合成法存在反应时间长,分离工艺复杂等缺点。通过改造微生物,利用合成生物学等手段合成5’-CMP引起了广泛关注。本研究首次针对大肠杆菌(Escherichia coli),利用代谢工程手段开发一株生产5’-CMP的工程菌株,同时通过系统途径优化策略显著提高了其产量。具体主要内容包括:(1)以*** MG1655为出发菌株,通过代谢工程手段构建胞苷5’-单磷酸高效生产菌株。首先采用CRISPR Cas9基因编辑技术敲除5’-CMP降解途径,阻断5’-CMP的降解。通过敲除基因ppn N阻断5’-CMP至胞嘧啶的降解途径,敲除基因ush A、yrf G、yjj G、ump H、ump G,阻断5’-CMP至胞苷的降解途径,获得的菌株*** CM006可以积累5’-CMP,其产量可达133.4 mg·L,与野生菌株相比,实现了5’-CMP的积累。(2)通过提高5’-CMP合成途径中关键酶的表达量,提高5’-CMP的积累。通过过量表达CTP到5’-CMP的5’-CTP二磷酸水解酶基因nud G,进一步获得的重组菌株*** CM007,5’-CMP的产量积累到183.0 mg·L。为减少中间代谢产物乳清酸的积累,表达乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr E促进了5’-CMP的合成。通过整合表达尿苷酸激酶突变体基因Pyr H(D93A),弱化5’-CMP合成途径中的限速步骤,进一步构建获得重组菌株*** CM009的5’-CMP产量达到253.0 mg·L。(3)通过减少胞苷积累,提高5’-CMP的积累。敲除胞苷脱氨酶基因cdd和过量表达尿苷-胞苷激酶基因udk,显著增加了5’-CMP的积累水平。整合表达PPP途径的关键酶基因prs、zwf、gnd,提高PPP途径的碳通量,增强前体物质PRPP的供应,构建获得重组菌株*** CM012的5’-CMP产量提高至417.9 mg·L。(4)在菌株*** CM012基础上引入枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子基因簇,获得重组菌株*** CM016,在***中重构了UMP合成途径,提高合成5’-CMP的前体物质供应,5’-CMP的摇瓶发酵产量达468.0 mg·L,进一步提高了其积累量。

关键词：大肠杆菌胞苷5’-单磷酸从头合成途径代谢工程

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代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2015年第1期31卷 105-114页

作者：李思梦李晓静陈涛天津大学化工学院教育部系统生物工程重点实验室天津300072 海军工程大学勤务学院天津300072

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定(3′-脱氧-2′,3′-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的重要前体物质。应用代谢工程方法对大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)生物合成胸苷进行了研究。通过敲除*** BL21嘧啶回补途径的deo A、tdk和udp三个基因,BS03... 详细信息

胸苷是抗艾滋病药物司他夫定(3′-脱氧-2′,3′-双脱氢胸苷)和叠氮胸苷的重要前体物质。应用代谢工程方法对大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)生物合成胸苷进行了研究。通过敲除*** BL21嘧啶回补途径的deo A、tdk和udp三个基因,BS03工程菌株能够积累21.6 mg/L胸苷。为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH的供给,进一步敲除pgi和pyr L使工程菌BS05胸苷的产量提高到90.5 mg/L。而通过过表达胸苷合成途径的ush A、thy A、dut、ndk、nrd A和nrd B六个基因,菌株BS08胸苷的产量能达到272 mg/L。通过分批补料发酵,BS08最终可以积累1 248.8 mg/L的胸苷。本研究结果表明经过代谢工程改造的*** BL21具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。

关键词：代谢工程胸苷从头合成途径

植物维生素B_6从头合成与代谢转换研究进展

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西北植物学报 2015年第10期35卷 2124-2131页

作者：黄龙全张剑韵安徽农业大学茶与食品科技学院合肥230036 安徽农业大学外国语学院合肥230036

维生素B6是一组可相互转换的吡啶衍生物的总称,包括吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醛。其中,磷酸吡哆醛是140多种细胞酶的辅酶。至今发现两种VB6从头合成途径,DXP(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸)依赖途径和DXP非... 详细信息

维生素B6是一组可相互转换的吡啶衍生物的总称,包括吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醛。其中,磷酸吡哆醛是140多种细胞酶的辅酶。至今发现两种VB6从头合成途径,DXP(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸)依赖途径和DXP非依赖途径,前者仅存在于大肠杆菌和少量其他细菌,后者存在于其他所有VB6自养生物。除了VB6的从头合成,所有细胞生物体内还存在一条相似的补救途径,补救途径实现VB6各型的代谢转换。该文对近年来国内外有关植物VB6从头合成和代谢转换研究进展进行综述。

关键词：植物维生素B6 从头合成途径补救途径