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利用同源重组构建人脑的酵母双杂交cdna文库

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同济大学学报（医学版） 2006年第4期27卷 36-39页

作者：李静琪刘立吕立夏李学礼徐磊同济大学基础医学院生化教研室上海200092

目的利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cdna文库。方法利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cdna第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离... 详细信息

目的利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cdna文库。方法利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cdna第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离PCR，扩增双链cdna。同时构建pGADT7-Rec质粒载体。纯化的ds cdna与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态Y187，经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD／-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人脑cdna文库。结果所获得的文库容量为1．2×10^6，重组子不同插入片断大小在0．3～2kb之间。结论在酵母菌株Y187成功构建了用于酵母双杂交的人脑cdna文库。

关键词： SMART技术同源重组酵母双杂交人脑cdna文库

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人18周胎儿脑cdna文库的构建及鉴定

复旦学报（自然科学版） 1997年第5期36卷 512-516页

作者：林卿杨岐生殷明金丽娟肖谷田叶蕴辉刘建平王玮谢毅复旦大学遗传学研究所上海200433 浙江大学海军医学研究所北京协和医科大学复旦大学

许多脑基因的特异性表达对人脑的发育、分化有着重要的作用．为了研究这些基因的结构和功能，构建了一个人18周胎儿脑cdna文库．抽提总mRNA后，经过一系列的酶促反应合成cdna．分级分离柱除去小片段后克隆到λgt10载体中．转染宿主菌C60... 详细信息

许多脑基因的特异性表达对人脑的发育、分化有着重要的作用．为了研究这些基因的结构和功能，构建了一个人18周胎儿脑cdna文库．抽提总mRNA后，经过一系列的酶促反应合成cdna．分级分离柱除去小片段后克隆到λgt10载体中．转染宿主菌C600hfl后文库包装效率为4．6×106pfu／μg，cdna平均插入片段大于1．2kbp．根据已知序列设计引物，从cdna文库中扩增出神经生长因子（NGF）的全长编码基因．

关键词：胎儿人脑cdna文库胚胎学基因人类遗传学

应用酵母双杂交系统筛选与禽流感核蛋白相互作用的蛋白质

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应用酵母双杂交系统筛选与禽流感核蛋白相互作用的蛋白质

作者：尹文偲华中农业大学

学位级别：硕士

禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。禽流感核蛋白(nucleoprotein, NP)是流感病毒的结构蛋白,不仅在流感病毒的复制及感染方面起重要作用,还是决定病毒的宿主特异性的一个重要蛋白。NP... 详细信息

禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。禽流感核蛋白(nucleoprotein, NP)是流感病毒的结构蛋白,不仅在流感病毒的复制及感染方面起重要作用,还是决定病毒的宿主特异性的一个重要蛋白。NP对病毒在宿主细胞的穿梭过程也起到了决定性作用,它可以同细胞多肽如肌动蛋白相互作用,对与禽流感病毒核衣壳蛋白复合体以及相关蛋白的出核运输有较为重要的功能。为了了解禽流感核蛋白NP对病毒的转录,复制和包装的作用,以及它能和细胞内哪些蛋白相互作用,本实验应用了酵母双杂交技术筛选对禽流感核蛋白NP相互作用的蛋白。本研究以禽流感核蛋白NP为诱饵,构建了诱饵质粒pGBKT7-NP,并对这个质粒进行了对酵母菌的毒性的检测,以及进行了自身能否激活报告基因的检测。结果表明该诱饵质粒并没有影响酵母的正常生长,同时也没有发现自激活现象,能够应用于筛选。将此诱饵质粒转入酵母菌AH109和携带文库的Y187酵母菌进行交配,利用显微镜观测到这两种不同交配型的酵母配子体通过交配形成了二倍体。两者的结合菌使得两种不同的质粒转入了同一酵母菌株中,并且发生了一定的相互作用,报告基因被激活,表达下游基因,从而筛选到诱饵蛋白与人脑cdna文库的靶蛋白。营救筛选得到酵母质粒,并将这些质粒用同样的酵母转化的方法各自与pGBKT7质粒共转入酵母感受态AH109中,在用缺少腺嘌呤,组氨酸的SD培养基(SD/-Trp/-Leu)和用缺少腺嘌呤,组氨酸,亮氨酸和色氨酸的SD培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)平板上培养。在SD/-Trp/-Leu能长出1～2mm的克隆,而SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上却没有,表明筛选到的单一文库质粒不能自发激活报告基因。通过NCBI中BLAST分析,得到了明确的蛋白序列,并从中挑选了与NP相互作的12种融合蛋白质。这12种蛋白分别为鸟苷酸调节蛋白(GNAS1), FERM和PDZ复合蛋白,转录调节因子LM04,果糖二磷酸醛缩酶C,蛋白精氨酸N-甲基转移酶1 (protein arginine methyltransferase 1),网格蛋白(clathrin), ATP酶,肽基脯氨酰顺反异构酶Pinl (protein interaction with NIMA1),锌指蛋白668(zinc finger protein 668),HIF缺氧诱发因子-1,微管相关蛋白MAP1A(microtubule-associated protein 1 A)及微管相关蛋白MAP1B(microtubule-associated protein 1B)。这些蛋白在功能上都可能和禽流感核蛋白NP存在着一定的关系。为了进一步验证诱饵质粒和所筛选到的阳性克隆是能够发生相互作用的,我们又将诱饵质粒和各个阳性质粒pGADT7-Prey共转到酵母菌AH109中进行回复验证,并用X-gal进行显色,从而在酵母细胞中初步验证了它们的相互作用。

关键词：禽流感核蛋白人脑cdna文库酵母双杂交系统蛋白间相互作用

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酵母双杂交系统筛选人DND1相互作用蛋白

酵母双杂交系统筛选人DND1相互作用蛋白

作者：粟艳林湖南师范大学

学位级别：硕士

目的：本课题研究的目的是在正常人脑cdna文库中通过酵母双杂交技术筛选与人DND1相互作用的蛋白质,并对筛选出的蛋白质进行相关功能初步分析,为进一步研究人DND1的功能及信号通路奠定基础。方法：(1)以人dnd1cdna为模板用PCR的方法扩增... 详细信息

目的：本课题研究的目的是在正常人脑cdna文库中通过酵母双杂交技术筛选与人DND1相互作用的蛋白质,并对筛选出的蛋白质进行相关功能初步分析,为进一步研究人DND1的功能及信号通路奠定基础。方法：(1)以人dnd1cdna为模板用PCR的方法扩增人dndl目的基因,目的片段和重组质粒行双酶切,连接,转化大肠杆菌,构建人DND1蛋白的酵母双杂交诱饵质粒pDBleu-dnd1,测序比对结果匹配后检验其毒性和自激活性,同时扩增正常人脑cdna文库,为下一步进行DND1蛋白的相互作用蛋白筛选及相互作用网络的构建奠定基础;(2)在正常人脑cdna文库中,利用酵母双杂交技术筛选与人DND1相互作用的蛋白,得到的阳性克隆质粒行双酶切及测序鉴定;(3)用共转化法将诱饵质粒pDBleu-dnd1和阳性克隆质粒回转入酵母菌AH109中进一步验证;(4)回转验证阳性克隆质粒提取后行测序及同源性分析。结果：(1)构建了穿梭质粒pDBleu-dnd1,并通过检测证实构建的重组质粒对酵母菌无毒性,无自激活性;(2)应用酵母双杂交技术以及生物信息学分析,我们在正常人脑组织的cdna文库中筛选出四个与人DND1有相互作用的蛋白质,分别为GRN, FLAD1, EFEMP1, RNF31。通过酵母双杂交回转验证及NCBI数据库中blast分析,排除酵母蛋白干扰、实验结果假阴性、假阳性,比对DNA序列100%匹配。结论：(1)成功构建用于酵母双杂交技术筛选的诱饵质粒pDBLeu-Dndl;(2)利用酵母双杂交技术我们成功的筛选出了与人DND1蛋白相互作用的四个蛋白质,分别为(GRN, FLAD1, EFEMP1, RNF31)。

关键词：人DND1蛋白人脑cdna文库酵母双杂交系统蛋白质相互作用

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20周人胎脑cdna文库的构建

氨基酸和生物资源 2001年第4期23卷 17-20页

作者：殷明林卿戴建凉应康李奕刘忠权海军医学研究所复旦大学遗传学研究所上海200433

为了研究舰船有害气体、噪声、磁场等特殊环境下人脑特异性基因表达的变化情况 ,构建了一个 2 0周人胎脑cdna文库 ,实验从胎脑组织中抽提总mRNA后 ,经过一系列酶反应后合成cdna ,分级分离柱除去小片段后克隆到λgt1 0载体 ,转染宿主菌E ... 详细信息

为了研究舰船有害气体、噪声、磁场等特殊环境下人脑特异性基因表达的变化情况 ,构建了一个 2 0周人胎脑cdna文库 ,实验从胎脑组织中抽提总mRNA后 ,经过一系列酶反应后合成cdna ,分级分离柱除去小片段后克隆到λgt1 0载体 ,转染宿主菌E .coli.C6 0 0hf1后文库的包装效率为 4 .6× 1 0 6pfu/μg ,cdna平均插入片段大于 1 .

关键词：人脑cdna文库滴度胎脑组织