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乌司他丁通过Rho/ROCK信号通路抑制炎症状态下血管内皮高通透性的研究

乌司他丁通过Rho/ROCK信号通路抑制炎症状态下血管内皮高通透性的...

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作者：魏伏重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分:乌司他丁对TNF-α作用下***926细胞通透性的影响及相关机制的研究目的:探讨乌司他丁(UTI)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致血管内皮细胞通透性增加的影响及其主要的分子机制。方法:以TNF-α干预人脐静脉内皮细胞株***926,建立炎... 详细信息

第一部分:乌司他丁对TNF-α作用下***926细胞通透性的影响及相关机制的研究目的:探讨乌司他丁(UTI)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)所致血管内皮细胞通透性增加的影响及其主要的分子机制。方法:以TNF-α干预人脐静脉内皮细胞株***926,建立炎症刺激的细胞模型,用UTI干预***926细胞,构建Rho A过表达慢病毒,采用Transwell法、TEER法检测细胞通透性;免疫荧光法测肌球蛋白磷酸酶结合亚基1(p-MYPT1)的表达及细胞纤维肌动蛋白(F-actin)形态及分布;分别采用免疫细胞化学法、Western Blot法及q RT-PCR法检测与通透性相关的关键分子Rho A、Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶Ⅱ(ROCK2)、MYPT1、p-MYPT1及内皮血管钙黏蛋白(VE-cadherin)表达的变化情况。结果:***-α作用下***926单层细胞电阻值明显降低,细胞通透性显著升高(P细胞内p-MYPT1的表达量较正常组明显增加,F-actin细胞骨架明显重新分布,细胞内应力纤维增多,VE-cadherin的表达量明显降低,而UTI可改善***926的上述变化情况;2.免疫细胞化学及Western Blot结果均显示,与正常对照组比较,TNF-α使Rho A、ROCK2的表达明显增加(均P细胞相比,UTI和TNF-α作用下,Rho A过表达使细胞内Rho A、ROCK2及p-MYPT1的表达显著增高,VE-cadherin表达降低,细胞通透性增加(均P细胞通透性无明显影响(均P>0.05)。结论:UTI以剂量依赖性方式抑制TNF-α引起的***926细胞通透性增加,这一作用可能与Rho/ROCK信号通路有关。第二部分:乌司他丁对脂多糖诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制目的:探讨乌司他丁(UTI)对脂多糖(LPS)诱导脓毒症小鼠肺损伤的保护作用及其可能机制。方法:1.将C57BL/6小鼠随机分为对照组(Con组,n=10)、模型组(LPS组,n=10)及UTI干预组(L+U组,n=30),建立LPS脓毒症小鼠模型;2.采用肺组织肺湿干重比(W/D)法及伊文思蓝染色(Evans Blue,EB)法观察各组小鼠肺组织含水量及肺微血管通透性的变化;***染色法检测各组小鼠肺组织病理变化;4.免疫组化法检测肺组织VE-cadherin及ROCK2表达水平的变化。结果:1.与对照组比较,LPS组小鼠肺组织W/D及EB含量均显著增加(均P<0.05),而UTI干预组W/D及EB含量明显降低,其中UTI在104 U/kg、105 U/kg剂量时,与LPS组相比,有统计学差异(均P<0.05);2.与对照组小鼠肺组织相比,LPS组小鼠肺组织水肿,损伤严重,而UTI干预组肺组织损伤明显减轻;3.免疫组化结果显示,LPS组小鼠肺组织VE-cadherin的表达明显降低,ROCK2的表达明显增高(均P<0.05),而UTI干预后,VE-cadherin的表达显著增加,ROCK2的表达显著下降(均P<0.05)。结论:UTI以一定的剂量依赖性降低LPS所致的肺毛细血管通透性增加,从而改善脓毒症小鼠肺损伤,这一作用可能与UTI抑制Rho/ROCK信号通路的激活有关。

关键词：人脐静脉内皮细胞系ea.hy926 乌司他丁肿瘤坏死因子-α 高通透性 Rho/ROCK信号通路乌司他丁脂多糖肺损伤血管钙黏蛋白 Rho/ROCK信号通路

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嗜铬粒蛋白A衍生多肽CHR抑制炎症所致血管内皮细胞高通透性的作用和初步机制探讨

嗜铬粒蛋白A衍生多肽CHR抑制炎症所致血管内皮细胞高通透性的作用...

引用

作者：古妮娜重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：观察嗜铬粒蛋白A衍生多肽CGA47-66（Chromfungin，CHR）对炎症介质引起的血管内皮细胞高通透性的影响，以及探讨其初步机制。方法：分别用CHR、脓毒性休克患者血清、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用人脐静脉内皮细胞株***926。（1... 详细信息

目的：观察嗜铬粒蛋白A衍生多肽CGA47-66（Chromfungin，CHR）对炎症介质引起的血管内皮细胞高通透性的影响，以及探讨其初步机制。方法：分别用CHR、脓毒性休克患者血清、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作用人脐静脉内皮细胞株***926。（1）采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、Transwell小室法测定***926的活性〔吸光度（A）值〕和通透性（A值）。（2）应用免疫荧光法、PCR和Western-blot分别观察细胞纤维肌动蛋白（F-actin）的形态和血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin的表达及分布，检测血管内皮钙粘蛋白VE-cadherin mRNA表达，以及ROCK、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK等同渗透性相关蛋白的表达。结果：（1）观察CHR对***926的活性和通透性的影响。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR对***926细胞活性无明显影响，而1000nmol/L CHR对***926细胞活性有显著抑制作用（A值：1.049±0.256比1.306±0.162，t=-2.390, P=0.031）。与空白对照组比较，1、10、100nmol/L CHR组***926细胞的通透性明显降低（A值：1.619±0.324、1.496±0.356、1.132±0.280比2.315±0.440，均P＜0.05）;脓毒性休克患者血清组和TNF-α组***926细胞通透性明显升高（血清组A值：1.204±0.248比0.277±0.017，t=9.145, P=0.000;TNF-α组A值：2.485±0.113比1.602±0.679，t=2.868，P=0.043）;1、10、100nmol/LCHR可明显降低脓毒性休克患者血清和TNF-α引起的***926细胞高通透性（血清组A值：0.299±0.065、0.224±0.028、0.131±0.015比1.204±0.248，均P＜0.05;TNF-α组A值：1.995±0.394、1.920±0.096、1.744±0.475比2.485±0.113，均P＜0.05），且在1～100nmol/L范围内，CHR的上述作用呈现一定的剂量依赖性。（2）检测CHR对渗透性相关分子的影响。应用PCR技术观察TNF-α组中VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组的显著降低（1.15±0.03比1.59±0.16，P926细胞的VE-cadherin mRNA的表达较空白对照组有显著增加（1.51±0.04、1.62±0.17、1.92±0.36比1.16±0.19，P细胞骨架发生明显重组和再分布，应力纤维形成增多，VE-cadherin的表达也明显减少，而CHR可以抑制上述变化。Western-blot检测到TNF-α组***926细胞的ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显高于空白对照组，TNF-α+CHR组与TNF-α组相比，TNF-α+CHR组中ROCK、磷酸化p38MAPK蛋白表达明显降低;空白对照组和各实验组相比，总p38MAPK蛋白表达无明显差异。结论：CGA衍生多肽CHR能改善炎症介质（脓毒性患者血清和TNF-α）引起的血管内皮细胞高通透性，这一作用在一定剂量范围内呈剂量依赖性，并且可能与RhoA/ROCK、p38MAPK信号通路相关。

关键词：嗜铬粒蛋白A 多肽 CHR 人脐静脉内皮细胞系ea.hy926 内皮细胞通透性炎症介质脓毒性休克肿瘤坏死因子

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