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猿猴病毒40T抗原转化的人脐静脉内皮细胞系PUMC-HUVEC-T1的建立

解剖学报 2013年第2期44卷 199-203页

作者：冯海凉王春景顾蓓杨振丽刘玉琴中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心北京100005

目的建立猿猴病毒40(SV40)T抗原转化的人脐静脉内皮细胞(HVUEC)模型,为内皮研究提供可利用资源。方法分离人脐静脉内皮细胞,原代培养。感染含有SV40大T、小T抗原的慢病毒,连续传代培养。对感染后的HUVEC,RT-PCR检测大T的表达,免疫细胞... 详细信息

目的建立猿猴病毒40(SV40)T抗原转化的人脐静脉内皮细胞(HVUEC)模型,为内皮研究提供可利用资源。方法分离人脐静脉内皮细胞,原代培养。感染含有SV40大T、小T抗原的慢病毒,连续传代培养。对感染后的HUVEC,RT-PCR检测大T的表达,免疫细胞化学检测vWF、CD31、CD34的表达及结合凝集素能力,透射电镜观察内皮细胞的超微结构,Matrigel检测管状成型,进行染色体核型分析,皮下接种BABL/c-nu裸鼠检测致瘤性,PCR法进行种属鉴定及支原体检测,短串联重复序列(STR)检测鉴定细胞身份。结果转化后的人脐静脉内皮细胞命名为PUMC-HUVEC-T1,扁平多角状,汇合时典型铺路石排列,体外传代40代以上(1∶3～4);细胞中有SV40LT mRNA的表达;vWF、CD31、CD34表达均阳性,可结合荆豆凝集素-1(UEA-1);电镜可见WP小体;不同代数细胞核型正常稳定,裸鼠体内接种不成瘤。PUMC-HUVEC-T1种属鉴定为人源性,STR结果与原代HUVEC一致,无支原体的污染,国家实验细胞资源共享平台收藏。结论建立了易获得、背景清楚、质量可靠的SV40 T抗原转化的HUVEC细胞系PUMC-HUVEC-T1。

关键词：人脐静脉内皮 SV40 反转录-聚合酶链反应免疫组织化学透射电镜

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内质网应激在高血压血管内皮细胞损伤中的作用研究

内质网应激在高血压血管内皮细胞损伤中的作用研究

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作者：路静宁夏医科大学

学位级别：硕士

研究目的为探讨内质网应激（ER Stress）在高血压导致内皮细胞损伤中的作用，本实验通过培养人脐静脉内皮细胞（human umbilieal vein endothelial cells，HUVECs），不同浓度血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）持续刺激24小时模拟高血压状态， MTT... 详细信息

研究目的为探讨内质网应激（ER Stress）在高血压导致内皮细胞损伤中的作用，本实验通过培养人脐静脉内皮细胞（human umbilieal vein endothelial cells，HUVECs），不同浓度血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）持续刺激24小时模拟高血压状态， MTT法检测细胞的凋亡率，透射电镜观察内质网的形态学改变，免疫荧光化学和western-blotting法检测内质网应激（ER Stress）标记蛋白PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα及PDI在内皮细胞中的表达;为进一步证实ER Stress在高血压血管重构和高血压内皮细胞损伤中的作用，本实验用免疫组化染色观察PERK在不同周龄自发性高血压大鼠（SHR）大鼠主动脉中的表达，从而进一步明确高血压发生发展的可能机制。研究方法第一部分：选择生长状态良好的5~8代体外培养HUVECs进行实验。相差显微镜观察细胞生长情况，待细胞活力旺盛即细胞处于对数期生长时，无血清培养6h，分组如下：①AngⅡ1组（10-5mol/L AngⅡ+无血清培养基，培养24h）②AngⅡ2组（10-6mol/LAngⅡ+无血清培养基,培养24h）③AngⅡ3组（10-8mol/L AngⅡ+无血清培养基,培养24h）④ER Stress阻断剂组（ER Stress阻断剂salubrinal+无血清培养基1h后，加入AngⅡ使终浓度至10-6mol/L，培养24h）⑤空白对照组（无血清培养基，培养24h）。收集细胞，MTT法检测细胞凋亡率，透射电镜观察内质网的形态学改变，细胞免疫荧光化学和western-blotting法检测ER Stress标记蛋白PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα及PDI在内皮细胞中的表达，并观察PERK通路阻断剂salubrinal对HUVECs是否有保护作用。第二部分：饲养雄性自发性高血压大鼠（SHR）和Wistar Kyoto（WKY）大鼠各15只，每周测大鼠尾动脉压一次，分别在8、16、24周龄处死动物，取出胸主动脉，HE染色观察不同周龄高血压大鼠血管内皮细胞变化，免疫组化染色观察ER stress重要成员PERK在大鼠主动脉内皮细胞中的表达。研究结果第一部分：经MTT法检测，与对照组相比较，AngⅡ处理后HUVECs的凋亡率明显增加，随着AngⅡ浓度的增高（10-9mol/L~10-4mol/L），HUVECs的凋亡率明显增加（P＜0.05）。透射电镜下观察，10-8mol/L AngⅡ处理的HUVECs出现细胞核膜不清晰，粗面内质网高度扩张、颗粒不完整;10-5mol/LAngⅡ处理的HUVECs大量细胞胞核消失，核仁崩解碎裂，细胞器稀少，内质网消失。免疫荧光化学和western-blotting检测结果表明，HUVECs正常情况下仅表达少量的PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα，AngⅡ处理显著上调PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白的表达（P＜0.05），且随着AngⅡ浓度增加，培养的HUVECs中ER stress标志蛋白表达量逐渐增加（P＜0.05），呈现浓度依赖性;经统计学分析，PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα两两之间成正相关（P＜0.05）;各组细胞中PDI蛋白的表达没有明显差异（P＞0.05）。观察发现，PERK通路阻断剂salubrinal对AngⅡ诱导的HUVECs凋亡没有明显的保护作用，且salubrinal本身对HUVECs有一定的毒性。第二部分：随着周龄的增加，SHR大鼠的动脉血压持续增高;8周龄开始, SHR大鼠的主动脉血管内皮细胞粗糙不平，并出现部分脱落，16周龄和24周龄后，出现的内皮细胞脱落逐渐增多;免疫组化检测，PERK在SHR组大鼠中的表达均高于同周龄的WKY组大鼠，且随着周龄的增加，PERK在SHR组大鼠中的表达也持续增加。结论 1.高血压状态可以导致血管内皮细胞损伤，凋亡率增加;2. PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白等内质网应激通路蛋白可能参与了高血压诱导的血管内皮细胞损伤;3. PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα具有协同作用，共同参与高血压诱导的血管内皮损伤。

关键词：高血压内皮细胞内质网应激血管紧张素Ⅱ 人脐静脉内皮

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CRISPR/Cas9介导可逆永生化内皮细胞系建立及主动脉瓣疾病潜在应用分析

CRISPR/Cas9介导可逆永生化内皮细胞系建立及主动脉瓣疾病潜在应...

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作者：邵晗琪北京协和医学院

学位级别：硕士

目的本研究旨在建立共表达Cas9和SV40 LT的血管内皮细胞系,方便内皮细胞的大量培养,后续利用CRISPR系统切除SV40 LT或任何基因,用于心血管疾病及癌症等分子机制研究。方法首先构建共表达Cas9和SV40 LT的永生化人脐静脉内皮细胞系。两条... 详细信息

目的本研究旨在建立共表达Cas9和SV40 LT的血管内皮细胞系,方便内皮细胞的大量培养,后续利用CRISPR系统切除SV40 LT或任何基因,用于心血管疾病及癌症等分子机制研究。方法首先构建共表达Cas9和SV40 LT的永生化人脐静脉内皮细胞系。两条技术路线:两步法是先后分别转染表达SV40 LT和Cas9的慢病毒载体,得到HUVEC2-CTG;一步法是利用overlap PCR和同源重组法构建慢病毒载体Lv-EF1 α-Cas9-IR ES-SV40 LT,然后感染原代HUVEC2,得到HUVEC2-CT。随后设计并筛选针对S V40 LT 的 CRISPR 系统,转染 HUVEC2-CTG 细胞,得到 HUVEC2-C△TG。用 We stern Blotting在蛋白水平验证Cas9对SV40 LT的切除效果。用CCK8法检测HU VEC2-CΔTG细胞体外增殖情况,免疫细胞化学检测CD31、CD34,vWF,并研究SV40 LT切除前后内皮细胞Matrigel管型形成功能,用转录组测序比较SV40 LT切除前后内皮细胞的转录组差异。在GEO数据库上挖掘出CAVD相关的基因和m iRNA数据,利用生物信息学方法来甄别差异性基因和miRNA。对具有差异性表达特征的的基因组网络进行了生物学反应过程与分子通路的聚类分析,并且研究和分析了 miRNA-基因调控网络,寻找利用建立的血管内皮细胞进行深入机制研究的切入点。结果我们分离培养出了原代人脐静脉血管内皮细胞,命名为PUMC-HUVEC2,其形态表现为典型的鹅卵石样。在感染SV40 LT-GFP后,利用PCR/Western Blottin g分别检测到在DNA/蛋白两个层次上SV40 LT的表达,命名为HUVEC2-TG,呈内皮形态、结合凝集素。进一步转染Cas9,获得稳定表达的HUVEC2-CTG,West ern Blotting显示在挑取的25个单克隆细胞株中23个有Cas9表达,基因组DNA检测也显示Cas9阳性。HUVEC2-CTG为内皮形态、结合凝集素。构建的慢病毒载体Lv-EF1α-Cas9-IRES-SV40 LT测序正确后,一步转染获得了 Cas9和SV40 LT共同稳定表达的HUVEC2-CT,在基因组DNA中检测到了Cas9和SV40 LT的表达。构建的针对SV40 LT的CRISPR系统,转染至HUVEC2-CTG细胞中,得到了HUVEC2-C△TG。用CCK8法检测HUVEC2-C△TG细胞体外增殖情况,结果证明敲除后的细胞生长速度显著低于对照组细胞,其中HUVEC2-C△TG-27切除前3、5、7天的OD值分部是(0.45±0.017)、(0.64±0.067)和(0.93±0.110),切除后3天(0.24±0.005)、5天(0.30±0.011)、7天(0.27±0.011)明显降低(P 值均小于0.001),表明HUVEC2-C△TG细胞的体外增殖能力下降。根据CCK8检测HUVEC2-C△TG细胞的增殖情况的结果,选择SV40 LT切除效果最好的HUVEC2-C△TG-27,免疫细胞化学验证HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-27/HUVEC2-C△TG-27细胞的内皮细胞特性,结果显示CD31、CD34以及vWF均表达为阳性,并未见明显差异。HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-8、22、27/HUVEC2-C△TG-8、22、27 内皮细胞 Matrigel管型形成功能结果显示,这些内皮细胞在Matrigel上均可以形成典型的管样结构,未发现明显差异。根据转录组表达谱全面分析的结果来看,HUVEC2-CTG-8、22、27在SV40 LT切除前细胞增殖相关基因就存在差异表达,与其SV40 LT和Cas9在基因组中插入的位置不同有关。随后分析了切除SV40 LT后发生显著差异表达的基因,发现分别有246、141、506个基因发生差异表达。我们进一步对差异基因进行分子通路聚类分析,从中发现三个细胞株中免疫反应相关通路都上调,而下调通路并不一致,其中细胞HUVEC2-CΔTG-8下调基因主要集中在细胞骨架重塑、细胞趋附与细胞周期相关通路,细胞HUVEC2-CΔTG-22下调基因主要集中在纤维化形成相关通路,细胞HUVEC2-C△TG-27下调基因主要集中在代谢相关通路。我们重点关注了与细胞增殖相关的基因变化,发现SV40LT切除后的差异基因中部分细胞增殖相关基因在不同细胞株中发生相同的变化。我们进一步分析了这些细胞增殖相关的差异基因的分子通路,发现在三个细胞株中,增殖相关的差异基因均能聚类到胰岛素样生长因子(IGF)相关通路,其中主要是IGF结合蛋白(IBP)4-7发生变化。通过对CAVD患者的差异基因进行生物信息学分析,发现

关键词：人脐静脉内皮 SV40 LT CRISPR/Cas9 主动脉瓣钙化基因表达

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妊娠大鼠着床后短暂抑制雌激素对胎盘血管发育的影响

妊娠大鼠着床后短暂抑制雌激素对胎盘血管发育的影响

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作者：孙明明北京协和医学院

学位级别：硕士

雌激素和孕激素是妊娠过程中重要的甾体类激素,正常的雌、孕激素水平是保证妊娠成功的关键所在,同时也是维持妊娠的最基本条件。胎盘是哺乳动物在妊娠早期由胚胎的胚膜和母体的子宫内膜联合生长而形成的母胎间物质交换的过渡性器官,并... 详细信息

雌激素和孕激素是妊娠过程中重要的甾体类激素,正常的雌、孕激素水平是保证妊娠成功的关键所在,同时也是维持妊娠的最基本条件。胎盘是哺乳动物在妊娠早期由胚胎的胚膜和母体的子宫内膜联合生长而形成的母胎间物质交换的过渡性器官,并且是妊娠成功的保障。另外,胎盘血管化是胎盘具备母胎物质交换功能的重要原因,在整个妊娠期维持胎盘血管的数量对正常妊娠具有重要意义。目的:研究着床期后短暂抑制雌激素合成对大鼠胎盘血管发育的影响。方法:实验组分别在GD6.5、GD7.5、GD8.5连续三天按照0.16 mg/kg/d给予来曲唑灌胃,对照组分别在GD6.5、GD7.5、GD8.5连续三天灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液,分离GD16.5、GD19.5和GD22.5胎盘称重,尾静脉取血,测量外周血雌激素水平,苏木素伊红染色和CD34抗体特异性检测胎盘血管发育;不同浓度（10-10、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L）的E2与HUVECs一起培养,并设置空白对照组,用CCK-8法检测HUVECs的细胞活力,划痕实验检测HUVECs的迁移功能,Transweel实验检测HUVECs的侵袭功能,成管实验检测HUVECs的成管功能,Real-time PCR检测Vegf mRNA的表达量;通过大鼠胚胎组织基因芯片检测研究实验组差异表达的基因,通过细胞迁移、侵袭、成管实验检测血管生成素样蛋白8（ANGPTL8）和趋化因子12（CXCL12）对HUVECs迁移、侵袭、成管能力的影响,通过蛋白免疫印记杂交检测ANGPTL8对人绒毛膜滋养层细胞（HTR8）表达CXCL12的影响。结果:与对照组相比实验组外周血雌激素水平呈下降趋势,同时胎盘重量明显上升,胎盘的血管发育明显不足;E2对于HUVECs的保护作用呈剂量效应关系,随着E2浓度升高,其促进HUVECs的增殖、迁移、侵袭、成管和Vegf mRNA的表达作用增强,但高浓度时则具有抑制效应;基因芯片检测结果显示,与对照组相比实验组Angptl8的表达上调,Cxcl12、Lefty1的表达下调;ANGPTL8减弱了 HUVECs的迁移、侵袭、成管能力;CXCL12增强了 HUVECs的迁移、侵袭、成管能力;ANGPTL8降低了 HTR8细胞表达CXCL12的能力。结论:着床后短暂抑制雌激素使胎盘血管发育呈现病理化的状态;E2对于HUVECs的保护作用呈剂量效应关系,随着E2浓度升高,其促进HUVECs的增殖、迁移、侵袭、成管和Vegf mRNA的表达作用增强,但高浓度时则具有明显的抑制效应;大鼠着床后短暂抑制雌激素,导致胎盘CXCL12蛋白水平降低,血管内皮细胞迁移、侵袭及成管功能受到抑制,ANGPTL8抑制了HTR8细胞表达CXCL12,且其自身也可以抑制血管内皮的迁移、侵袭及成管等功能。

关键词：雌激素胎盘人脐静脉内皮血管发育

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