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中华实验外科杂志 2018年第4期35卷 737-740页

作者：程田刘雯雯刘宏建关方霞郑州大学第一附属医院骨科 450052 郑州大学生命科学院 450001

目的观察人脐带沃顿胶（WJ）对脑外伤小鼠的神经修复作用。方法采用小鼠CCI脑外伤模型建立动物模型，将实验小鼠随机分为Veh和WJ移植组。术后3 d，干湿称重法检测小鼠损伤侧脑含水量，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测炎性因子肿瘤... 详细信息

目的观察人脐带沃顿胶（WJ）对脑外伤小鼠的神经修复作用。方法采用小鼠CCI脑外伤模型建立动物模型，将实验小鼠随机分为Veh和WJ移植组。术后3 d，干湿称重法检测小鼠损伤侧脑含水量，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-10的表达，碘化丙锭（PI）染色检测损伤附近区域坏死细胞数量；术后28 d，神经功能缺损评分评价小鼠运动功能，新物体识别实验检测小鼠认知功能，糖水偏好实验评价小鼠抑郁状况，实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测神经元特异性相关蛋白和神经营养因子表达。结果（1）WJ移植组小鼠脑含水量[（84.61±1.61）%]与Veh组比较[（11.06±2.24）%]明显降低，差异有统计学意义（t＝4.935，P＝0.001）。（2）小鼠神经功能缺损评分结果显示WJ移植组术后第7、14、21、28天神经功能缺损评分[（11.80±1.30）、（10.60±1.14）、（9.40±1.14）和（8.20±1.30）分]与Veh组比较有统计学意义[（9.80±1.09）、（8.40±1.14）、（7.20±1.09）和（5.80±0.84）分，P＝0.000]。（3）小鼠新物体识别实验结果显示WJ移植组小鼠新物体辨别率为（65.57±1.543）%，高于Veh组[（50.03±1.704）%]，差异有统计学意义（t＝6.760，P＝0.000）。（4）糖水偏嗜实验表明WJ移植组和Veh组比较差异有统计学意义[（63.05±2.10）%和（48.62±1.80）%，t＝4.935，P＝0.001]。（4）WJ移植组抑炎因子IL-10表达量[（659.39±14.40） pg/ml]明显高于Veh组[（554.39±15.54） pg/ml，t＝4.957，P＝0.008]，而促炎因子TNF-α（755.90±16.89） ng/ml明显低于Veh组[（1 081.22±14.81） ng/ml，t＝14.480，P＝0.000]。（5）WJ移植组神经元特异性相关蛋白微管相关蛋白-2（MAP-2）、双皮质蛋白（DCX）和神经营养因子脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子（NGF）的表达（0.94±0.18、1.38±0.06、1.02±0.02和0.85±0.67）明显高于Veh组（0.41±0.03、0.81±0.04、0.52±0.03和0.23±0.03），差异有统计学意义（t＝2.900，P＝0.044；t＝8.007，P＝0.001；t＝13.060，P＝0.000；t＝8.640，P＝0.001）。（6）对比Veh组[（321.60±17.98）个]，WJ移植组的坏死细胞数量显著减少[（179.60±18.95）个]，差异有统计学意义（t＝5.435，P＝0.001）。结论人脐带沃顿胶对脑外伤小鼠有神经修复作用。

关键词：人脐带沃顿胶脑外伤神经修复

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人脐带沃顿胶源性干细胞对脊髓损伤大鼠的修复作用及其对炎症因子表达的影响

人脐带沃顿胶源性干细胞对脊髓损伤大鼠的修复作用及其对炎症因子...

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作者：渠瑞娜郑州大学

学位级别：硕士

脊髓损伤（spinal cord injiiry，SCI)是脊髓遭受外力损伤后引起的一种组织损坏，其主要表现为损伤平面以下感觉和运动功能的丧失和大小便失禁等，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，对SCI的干预和治疗迫在眉睫。一般认为，SCI后复杂... 详细信息

脊髓损伤（spinal cord injiiry，SCI)是脊髓遭受外力损伤后引起的一种组织损坏，其主要表现为损伤平面以下感觉和运动功能的丧失和大小便失禁等，给家庭和社会带来沉重的负担。因此，对SCI的干预和治疗迫在眉睫。一般认为，SCI后复杂的病理机制是其难以治愈的根本原因。干细胞是一类具有自我更新能力和多分化潜能的细胞。近年来，干细胞所具有的独特性质及在难治性疾病中的治疗效果为SCI的治疗带来了希望。干细胞是一类具有自我更新能力和多分化潜能的细胞。In't Anker[l]等从脐带中分离培养出的MSCs，经过细胞表面免疫表型鉴定与骨髓来源的MSCs表面表型相似，且比骨髓来源的MSCs具有更强的扩增和分化能力，因而备受关注。本实验室的前期结果表明WJCs对脊髓损伤大鼠具有神经保护作用，能够促进其运动功能的恢复。但是，目前对WJCs治疗SCI的分子机制还不清楚，本实验旨在探讨人脐带沃顿胶间充质干细胞(mesenchymal stromal cells derived from Wharton's jelly cells, WJCs)移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用及其可能机制。方法1、采用组织块贴壁法体外分离培养WJCs，流式细胞术对其表面标记物进行检测;2、制作大鼠脊髓半切损伤模型，假手术组8只，模型组60只随机分为对照组和WJCs移植组，每组有Oh、3h、6h、12h、Id、3d、7d、14d、21d和28d共10个时间点，每个时间点3只大鼠（其中Id、3d、7d这3个时间点各6只）。WJCs移植组于损伤后10min经尾静脉注射200^11的WJCs单细胞悬液（约IxlO。个WJCs);3、移植后Id、3d、5d、7d、14d、21d和28d，应用BBB评分法评测WJCs治疗前后损伤大鼠运动功能的改善情况;4、移植后28d，应用免疫组织化学及透射电镜观察损伤脊髓组织形态学变化;5、移植后Oh、3h、6h、12h、Id、3d和7d应用实时劳光定量PCR检测各组大鼠伤段脊髓组织TNF-cu MCP-1和IL-10mRNA表达情况;移植后28d应用实时劳光定量PCR方法检测损伤大鼠脊髓组织BDNF、NSE、GFAP mRNA的表达情况;6、移植后Oh、3h、6h、12h、Id、3d和7d应用Westenrblot方法检测损伤大鼠脊髓组织MCP-1、TNF-a和IL-10蛋白表达情况;移植后28d应用Westenrblot方法检测损伤大鼠脊髓组织BDNF、NSE和GFAP蛋白的表达。结果1.损伤后，WJCs移植组与对照组大鼠运动功能均有不同程度的恢复，移植组大鼠的运动功能恢复较为明显。2.与对照组相比，WJCs移植组损伤区脊髓结构比较完整，轴索中心建立连接。对照组和WJCs移植组损伤脊髓MCP-1、TNF-a和IL-10mRNA及蛋白的表达较假手术组有明显的增加（p<0.05);WJCs移植组与对照组相比，MCP-1、TNF-a的表达在转录水平和蛋白水平均受到明显抑制(p<0.05)，而IL-10蛋白及mRNA的表达显著增强（p<0.05)。3.损伤后28d移植组和对照组伤段脊髓组织的GFAP、NSE和BDNFmRNA及蛋白的表达量均增加，且与对照组相比具有统计学意义（p<0.05)。结论WJCs静脉移植后可改变脊髓损伤区的微环境，上调损伤局部的抑炎因子IL-10的表达，降低促炎因子MCP-1和TNF-a的表达;同时，增加GFAP、NSE、BDNF等细胞因子的表达，进而促进大鼠神经功能恢复。这可能是WJCs调节免疫炎症反应减少脊髓继发性损伤，促进损伤大鼠脊髓结构与功能恢复的机制之一。

关键词：人脐带沃顿胶静脉移植脊髓损伤炎症因子

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人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复作用

人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复作用

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作者：李牧郑州大学

学位级别：硕士

目的面神经为周围神经系统重要的一支,是颅神经中走行最长的。因为其结构和位置的特殊性,极易受到损伤。损伤后的局部面神经根会发生脱髓鞘的改变。本实验观察大鼠面神经损伤后髓鞘修复效果及电生理变化的影响,测定局部髓鞘蛋白及细胞... 详细信息

目的面神经为周围神经系统重要的一支,是颅神经中走行最长的。因为其结构和位置的特殊性,极易受到损伤。损伤后的局部面神经根会发生脱髓鞘的改变。本实验观察大鼠面神经损伤后髓鞘修复效果及电生理变化的影响,测定局部髓鞘蛋白及细胞因子的表达分布,探讨可能的分子机制,为人脐带沃顿胶薄片修复面神经损伤奠定实验基础。方法将64只成年SD大鼠,体重180g-210g。采用随机数字表法将大鼠随机分成假手术组(n=14)、单纯损伤组(n=25)及人脐带沃顿胶薄片组(n=25),假手术组只暴露大鼠右耳茎乳突处面神经主干,面神经损伤模型组采用小号血管钳钳夹面神经主干10s,造成神经挤压伤模型。人脐带沃顿胶组织块置于培养基中激活后,采用细胞切片机,将人脐带沃顿胶组织块修剪成5mm×5mm薄片,贴附于面神经挤压伤处。分别于术后第1d、3d、10d、20d、30d观察面神经功能的恢复情况,观察大鼠眨眼反射、触须运动、及鼻尖位置居中等行为学的变化。术后第30d测定面神经电生理变化,记录大鼠口轮匝肌动作电位的波幅、潜伏期变化。取损伤处面神经主干,采用HE染色观察面神经的病理改变,免疫组化观察BDNF(脑源性神经营养因子)的表达情况。电镜观察面神经的超微结构。Western blot检测神经生长因子MBP,BDNF及NGF在损伤处的表达情况。ELISA测定面神经损伤区域炎症因子IL-1β、IL-10、TNF-α,NF-κB的分泌数量。结果术后第一天单纯损伤组及人沃顿胶薄片组大鼠的行为学表现为眼睑闭合不全,鼻尖偏向左侧,右侧触须运动消失。随着时间的延长,单纯损伤组大鼠面神经损伤变化并无明显改善,在1d、7d、10d、20d、30d各时间点面神经功能评分差异无统计学意义(F=4.57,P>0.05),人脐带沃顿胶薄片组的面神经功能行为学改善明显好转(F=10.35,P人脐带沃顿胶薄片组大鼠面神经复合肌肉动作电位的潜伏期及波幅分别为(1.04±0.75ms、1.73±0.44mv),单纯损伤组潜伏期及波幅分别为(6.10±1.80ms、0.67±0.19mv),二者差别有统计学意义(t=13.66,P人脐带沃顿薄组在术后30d染色缺损区域明显减少,面神经组织结构恢复、髓鞘完整性明显好转。免疫组化提示:与假手术组相比,单纯损伤组和沃顿胶薄片组BDNF蛋白免疫反应均存在阳性细胞。且沃顿胶薄片组阳性细胞数量更加明显。电镜观察显示沃顿胶薄片组治疗后髓鞘明显增厚,细胞器数量增多,空泡状改变明显变少。Western blot结果证实MBP,BDNF及NGF的表达在人脐带沃顿胶薄片组明显增多,与单纯损伤组相比差异有统计学意义(P人脐带沃顿胶薄片组IL-1β、IL-10、TNF-α,NF-κB表达明显降低。结论人脐带沃顿胶薄片能够促进大鼠面神经损伤后的髓鞘修复,改善大鼠面神经损伤后行为学及电生理情况,其机制可能与人脐带沃顿胶薄片上MBP表达,促进神经营养因子BDNF、NGF等的分泌,减少IL-1β、IL-10、TNF-α,NF-κB等相关炎症因子的分泌,改善损伤区域的局部微环境。

关键词：人脐带沃顿胶面神经损伤神经修复电生理

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沃顿胶对小鼠脑损伤后炎症和情绪的影响

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中华急诊医学杂志 2018年第7期27卷 779-784页

作者：程田刘雯雯马珊珊孙同文关方霞郑州大学第一附属医院郑州450052 郑州大学生命科学院郑州450000

目的探究移植人脐带沃顿胶（Wharton＇s jelly, WJ）对脑外伤（traumatic brain injury,TBI）小鼠炎症反应和抑郁情绪的影响。方法分离与培养脐带沃顿胶，流式细胞仪鉴定第三代脐带间充质干细胞的细胞表型。采用改良式自由落体脑外伤... 详细信息

目的探究移植人脐带沃顿胶（Wharton＇s jelly, WJ）对脑外伤（traumatic brain injury,TBI）小鼠炎症反应和抑郁情绪的影响。方法分离与培养脐带沃顿胶，流式细胞仪鉴定第三代脐带间充质干细胞的细胞表型。采用改良式自由落体脑外伤模型，将实验小鼠随机（随机数字法）分为两组：脑损伤＋生理盐水处理组（Veh 组），脑损伤＋WJ 移植组（WJ 组）。术后3 d，干湿称重法检测小鼠损伤侧脑含水量，Elisa 试剂盒检测炎症因子IL-1β 和TNF-α 的表达，HEt 染色检测损伤部位活性氧的积累，GFAP 免疫荧光染色检测星形胶质细胞的表达，Iba1 和CD68 免疫荧光染色检测小胶质细胞的表达；术后28 d，神经功能缺损评分评价小鼠运动功能，糖水偏好实验、悬尾实验和强迫游泳实验评价小鼠的认知和情绪状况。所得数据使用SPSS 21.0 软件，以均数±标准差（x±s）表示，不同时间点的比较采用重复测量设计的两因素ANOVA 分析。结果与Veh组相比，WJ 移植组小鼠神经功能缺损评分降低[1 d：（14.8±1.169 和15.2±1.472），3 d：（11.0±1.414和13.5±1.225），7 d：（9.5±1.517 和12.0±1.549），14 d：（7.7±0.816和10.5±1.643），21 d：（6.5±0.547和9.0±1.265），28 d ：（5.3±0.816 和7.8±1.169），P〈0.05]，糖水偏嗜度升高[（64.56±2.279）%和（54.49±1.505）%，P=0.004]，悬尾实验不动时间减少[（115.7±4.660）s 和（144.7±5.493）s，P〈0.01]，强迫游泳实验悬浮时间降低[（215.8±5.003）s 和（260.3±4.558）s，P=0.002]，脑含水量降低[（75.58±1.559）% 和（84.48±1.802）%，P=0.004]，炎症因子IL-1β 和TNF-α 水平均明显降低[（44.429±3.422）ng/mL 和（658.712±43.175）ng/mL,（70.717±4.124）ng/mL 和（1043.118±56.813）ng/mL，P=0.000 6 和0.000 3）]，损伤区域ROS 含量减少[（2 151±406.287）和（3 687±380.466），P=0.020]，活化的星形胶质细胞荧光强度明显降低[（1 658±312.912）和（2906±431.591），P=0.041]，小胶质细胞的数量减少[（15.167±1.249）个和（20.833±2.212）个，P=0.049]，活化的小胶质细胞同样减少[（13.500±2.094）个和（38.833±3.301）个，P〈0.01]。结论小鼠脑外伤后，人脐带沃顿胶对小鼠的抑郁情绪和炎症反应有明显改善作用。

关键词：人脐带沃顿胶脑外伤抑郁炎症反应

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