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京尼平交联Ⅰ型胶原蛋白材料与人脂肪间充质干细胞的生物相容性

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中国组织工程研究 2014年第34期18卷 5423-5428页

作者：王刚亢婷刘毅刘刚强兰州大学第二临床医学院甘肃省兰州市730030 解放军兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心甘肃省兰州市730050

背景:京尼平的低毒性具有一定的种属和细胞特异性,人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性对于应用两者构建组织工程脂肪至关重要。目的:评估人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物... 详细信息

背景:京尼平的低毒性具有一定的种属和细胞特异性,人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性对于应用两者构建组织工程脂肪至关重要。目的:评估人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性。方法:分离培养人脂肪间充质干细胞,传代培养至第3代,接种于京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料上。MTT法评估人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和增殖情况,支架材料对细胞的毒性作用;光镜和电镜分别观察人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和生长过程,以及细胞形态学变化。结果与结论:人脂肪间充质干细胞接种于支架材料后,能够迅速在材料上黏附、增殖,其黏附率平均为86.5%;光镜和扫描电镜显示人脂肪间充质干细胞在支架材料上黏附性良好,随着时间的推移,细胞逐渐增多,可以迁移进入支架内部并均匀分布。结果表明京尼平对细胞的毒性低,交联后的支架材料与人脂肪间充质干细胞具有良好的体外生物相容性。

关键词：生物材料材料相容性京尼平人脂肪间充质干细胞 Ⅰ型胶原蛋白生物相容性脂肪组织工程

荧光磁性纳米粒子标记三维培养系统中的脂肪间充质干细胞

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中国组织工程研究 2015年第1期19卷 44-48页

作者：吕品雷苏约翰崔大祥汪铮上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所上海市200001 上海交通大学微纳科学技术研究院纳米生物工程研究室上海市200240

背景:荧光磁性纳米粒子具有量子点和磁粒子的双重特质,生物相容性好,能够被胞吞入细胞质高效地标记细胞。目的:验证荧光磁性纳米粒子标记人脂肪间充质干细胞的可行性。方法:抽脂术抽取健康人脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离,贴壁培... 详细信息

背景:荧光磁性纳米粒子具有量子点和磁粒子的双重特质,生物相容性好,能够被胞吞入细胞质高效地标记细胞。目的:验证荧光磁性纳米粒子标记人脂肪间充质干细胞的可行性。方法:抽脂术抽取健康人脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离,贴壁培养纯化人脂肪间充质干细胞。取第6代脂肪间充质干细胞与荧光磁性纳米粒子孵育过夜,采用普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜检测体外标记细胞情况,荧光成像系统观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体内示踪效果。结果与结论:普鲁士蓝染色显示荧光磁性纳米粒子以蓝色颗粒的形式分散于脂肪间充质细胞胞质中。激光共聚焦显微镜观察显示人脂肪间充质干细胞的细胞核被Hoechest33258染成蓝色,细胞质被标记成绿色;荧光成像结果表明标记的人脂肪间充质干细胞具有很好的成像效果。结果提示荧光磁性纳米粒子可以作为示踪剂在体外标记人脂肪间充质干细胞,为脂肪间充质干细胞的移植转化研究提供新方法。

关键词：脂肪组织间质干细胞生物学标记干细胞脂肪干细胞荧光磁性纳米粒子人脂肪间充质干细胞荧光成像示踪剂国家自然科学基金

体外培养成人脂肪间充质干细胞及向平滑肌细胞诱导分化

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中国动脉硬化杂志 2009年第3期17卷 189-192页

作者：郭泽君边云飞薛君武卫东肖传实山西医科大学第二临床医学院山西省太原市030001 山西医科大学第二医院心内科山西省太原市030001

目的体外培养成人脂肪间充质干细胞,并应用转化生长因子β将脂肪间充质干细胞诱导分化为平滑肌细胞。方法采用酶消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪对第3代和第5代细胞进行表面抗原检测,对第5代细胞进行转化生长因... 详细信息

目的体外培养成人脂肪间充质干细胞,并应用转化生长因子β将脂肪间充质干细胞诱导分化为平滑肌细胞。方法采用酶消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪对第3代和第5代细胞进行表面抗原检测,对第5代细胞进行转化生长因子β诱导,于诱导后第10天进行免疫化学鉴定。结果体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平的长梭形,细胞形态均一,传代稳定。干细胞相关标志CD29和CD44表达阳性,造血干细胞相关标志CD34随传代次数的增加由弱阳性逐渐转为阴性,内皮细胞相关标志CD31表达阴性。流式细胞仪检测结果发现脂肪间充质干细胞中G0/G1、S和G2/M期的细胞分别占90.14%、3.77%和6.09%。转化生长因子β定向诱导后倒置显微镜下观察细胞呈"峰"、"谷"样形态,免疫荧光化学检测发现诱导组细胞α平滑肌肌动蛋白表达阳性。结论成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在转化生长因子β诱导后分化为平滑肌细胞。

关键词：人脂肪间充质干细胞转化生长因子β 平滑肌细胞细胞分化

富血小板血浆对脂肪间充质干细胞生物学行为的影响

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中国老年学杂志 2011年第6期31卷 997-999页

作者：王悦李玉梅王淑艳周延民吉林大学口腔医院麻醉科吉林长春130021 空军航空大学飞行训练基地门诊部吉林大学口腔医院种植中心

目的探讨富血小板血浆(PRP)对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)在体外培养条件下增殖、分化及细胞成骨能力的影响,研究PRP的生物学功能。方法健康志愿者静脉血经2次离心法制备PRP,氯化钙加入凝血酶激活后提取萃取液。hADSCs成骨诱导实验分4组... 详细信息

目的探讨富血小板血浆(PRP)对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)在体外培养条件下增殖、分化及细胞成骨能力的影响,研究PRP的生物学功能。方法健康志愿者静脉血经2次离心法制备PRP,氯化钙加入凝血酶激活后提取萃取液。hADSCs成骨诱导实验分4组,即空白对照组、只加成骨诱导液组、只加50%PRP 20μl组、既有成骨诱导液又加50%PRP 20μl组,倒置相差显微镜观察细胞增殖、分化。碱性磷酸酶(ALP)染色实验分4组,即空白对照组、不同浓度PRP(即原液、50%、25%)组,每孔各加20μl PRP,第6天ALP活性染色。细胞增殖能力检测,成骨诱导培养后2、4、6、8、16 d采用CCK-8法检测不同浓度PRP对细胞增殖活性的影响。结果成骨诱导实验中倒置相差显微镜见加PRP组细胞数量多于单纯诱导组和空白组,细胞形态多数为梭形;ALP活性检测见高浓度PRP组ALP阳性细胞深染,并有浓度依赖性。CCK-8测定细胞增殖活性,显示12.5%PRP组第4、6天平均OD值分别为0.035、-0.063,高于对照组(-0.833、-1.041)(P<0.05)。结论适宜浓度的PRP可促进hADSCs的增殖,但对其成骨分化有抑制作用。过高浓度的PRP虽然同样有促进增殖的作用,但并非浓度越高越好。

关键词：人脂肪间充质干细胞富血小板血浆增殖分化

射干苷和桃叶珊瑚苷抑制LPS诱导的人脂肪间充质干细胞炎性反应

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基础医学与临床 2019年第7期39卷 961-966页

作者：张乃月朱榕嘉尹秀平王巧玲韩钦赵春华宋坪中国中医科学院广安门医院皮肤科北京100053 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院中国医学科学院组织工程研究中心/干细胞新药研发及临床转化研究北京市重点实验室(BZ0381) 北京100005 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院北京100730 青岛大学山东青岛266071

目的研究射干苷(tectoridin)、桃叶珊瑚苷(aucubin)对脂多糖(LPS)诱导后人脂肪间充质干细胞(hAMSCs)免疫调控作用的影响。方法通过CCK-8细胞增殖实验和细胞周期检测实验,筛选合适的药物作用浓度;筛选LPS作用浓度,建立炎性反应模型;用EL... 详细信息

目的研究射干苷(tectoridin)、桃叶珊瑚苷(aucubin)对脂多糖(LPS)诱导后人脂肪间充质干细胞(hAMSCs)免疫调控作用的影响。方法通过CCK-8细胞增殖实验和细胞周期检测实验,筛选合适的药物作用浓度;筛选LPS作用浓度,建立炎性反应模型;用ELISA、RT-qPCR检测两者对LPS诱导后hAMSCs分泌促炎因子、抑炎因子的影响。结果50μg/mL射干苷和100μg/mL桃叶珊瑚苷能明显促进hAMSCs增殖(P<0.05,P<0.01);两者均促进LPS诱导后hAMSCs增殖(P<0.001);并且可抑制hAMSCs分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎因子(P<0.05,P<0.01)。结论射干苷、桃叶珊瑚苷可显著抑制LPS诱导的hAMSCs炎性反应。

关键词：人脂肪间充质干细胞炎性细胞因子免疫调控银屑病

白细胞介素8对高糖诱导的人脂肪间充质干细胞损伤的保护作用

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中国现代医学杂志 2016年第16期26卷 18-22页

作者：沈雷沙峰孙权张鹏孙石柱张晓东姚立杰李静平齐齐哈尔医学院解剖教研室黑龙江齐齐哈尔161006

目的探讨白细胞介素8(IL-8)对高糖诱导人脂肪间充质干细胞(h Ad MSC)损伤的保护作用。方法含250 mmol/L葡萄糖的培养基建立细胞高糖模型;P65质粒转染人IL-8基因到h Ad MSC为IL-8转染组,仅转染P65质粒者为P65对照组,在IL-8转染组中添加PD... 详细信息

目的探讨白细胞介素8(IL-8)对高糖诱导人脂肪间充质干细胞(h Ad MSC)损伤的保护作用。方法含250 mmol/L葡萄糖的培养基建立细胞高糖模型;P65质粒转染人IL-8基因到h Ad MSC为IL-8转染组,仅转染P65质粒者为P65对照组,在IL-8转染组中添加PD98059为Erk抑制剂组。利用MTT细胞增殖实验、ELISA或流式细胞技术检测各组h Ad MSC增殖的光密度值(OD值)、Caspase-3、Erk或VEGF等蛋白的表达。结果与P65对照组比较,IL-8转染组h Ad MSC增殖OD值明显升高,Caspase-3蛋白表达下降(P<0.01);IL-8转染组Erk蛋白活性和VEGF蛋白含量明显高于P65对照组(P<0.01);但与IL-8转染组比较,Erk抑制剂组h Ad MSC增殖的OD值降低,Caspase-3蛋白表达升高(P<0.01)。结论 IL-8在高糖环境下,通过Erk通路,发挥对h Ad MSC的保护作用。

关键词：高糖白细胞介素8 人脂肪间充质干细胞 Erk通路

人脂肪源间充质干细胞向肾系细胞诱导分化研究

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人脂肪源间充质干细胞向肾系细胞诱导分化研究

作者：杨倩北京协和医学院

学位级别：硕士

目的及内容近年来慢性肾脏疾病(chronic kidney disease, CDK)的发病率不断增加,其发展的最终结局是终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)没有办法靠人体自身修复。目前主要的治疗手段有血液透析、腹膜透析和肾移植。但是,血液透... 详细信息

目的及内容近年来慢性肾脏疾病(chronic kidney disease, CDK)的发病率不断增加,其发展的最终结局是终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)没有办法靠人体自身修复。目前主要的治疗手段有血液透析、腹膜透析和肾移植。但是,血液透析和腹膜透析只能部分代替肾脏的滤过功能;肾移植供体短缺且存在免疫排斥现象,抗排异药物的副作用大。这些治疗方法都存在严重缺陷,所以需要寻找更有效的治疗方法和途径。脂肪来源的间充质干细胞是一群具有贴壁能力的多潜能干细胞,具有低免疫原性和高度可塑性使之成为组织工程较为理想的种子细胞,也是近年来细胞治疗的最受瞩目的研究热点。研究发现,在体的或离体的胚胎组织均可以诱导干细胞向肾系细胞分化,但在体内诱导脂肪间充质干细胞分化而来的肾系细胞难以从体内分离纯化,无临床应用前景。如果能在体外诱导干细胞分化为肾系细胞,不仅将阐明重要科学问题,丰富再生医学的理论领域,并能为修复病损的肾功能提供新的治疗方案。本实验的第一部分,首先研究了人脂肪来源的间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)的生物学特征及其分化潜能;本实验分离培养得到的hAD-MSCs能够向脂肪细胞和成骨细胞分化,具有较强的可塑性,组织工程较为理想的种子细胞。第二部分,在体外通过将后肾间充质和输尿管芽与hAD-MSCs共培养、以及添加诱导培养基的方法,利用胎肾组织按体内发育规律释放的可溶性因子,诱导hAD-MSCs向肾系细胞的分化。第三部分,通过模拟肾脏胚胎发育过程,序贯添加细胞分化阶段必须的因子,诱导hAD-MSCs向肾系细胞定向分化,根据实际过程中的hAD-MSCs对诱导因子的反应性优化诱导分化方案。建立用于临床移植的肾脏细胞诱导分化体系。方法1.从人的脂肪组织中分离培养得到hAD-MSCs,观察细胞形态及生长特点,流式细胞仪检测细胞表面标志的表达;同时对培养细胞进行成脂、成骨诱导分化,采用油红。和碱性磷酸酶染色观察hAD-MSCs的诱导分化情况。2.从孕13.5的CD-1胎鼠中分离出后肾间充质和输尿管芽,一方面将分离得到的后肾间充质组织和输尿管芽通过Transwell系统进行间接共培养,诱导hAD-MSCs向肾系细胞定向分化。另一方面用后肾间充质组织和输尿管芽的条件培养基,诱导hAD-MSCs向肾系细胞定向分化。RT-PCR检测后肾微环境对hAD-MSCs表达肾脏发育相关和肾上皮细胞特征基因的影响。免疫细胞荧光染色检测后肾微环境对hAD-MSCs表达肾祖细胞和肾上皮细胞标志物的影响。3.体外通过添加诱导因子如激活素A(Activin A)、维甲酸(retinoic acid, RA)、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein, BMP7)和Wnt-4来模拟体内胚胎发育过程,诱导hAD-MSCs向肾脏足细胞分化。RT-PCR检测诱导后hAD-MSCs表达肾脏发育相关和肾上皮细胞特征基因的影响。免疫细胞荧光染色检测诱导后hAD-MSCs表达肾祖细胞和肾上皮细胞标志物的影响。根据实际过程中细胞对诱导因子的反应性优化诱导分化方案。结果1.原代hAD-MSCs呈集落生长,细胞呈梭形,传代后细胞生长迅速,形态均一呈成纤维样或三角形,细胞增殖能力强,具有自我更新能力。经流式细胞仪检测hAD-MSCs高表达CD29、CD44、CD 105和Flk-1,不表达CD34、CD 106、CD31和HLA-DR。hAD-MSCs在成脂诱导培养基诱导后,细胞内可见折光性强的圆形脂滴,油红O染色呈红色;在成骨诱导培养基诱导后,碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色呈阳性。2. hAD-MSCs与胎肾组织及其条件培养基培养后,通过RT-PCR和免疫细胞荧光染色检测到诱导后hAD-MSCs表达肾脏发育相关基因和蛋白。3.体外添加诱导因子诱导后,通过RT-PCR和免疫细胞荧光染色检测到诱导后hAD-MSCs表达肾祖细胞和肾上皮细胞标志物。结论1.成功分离培养了hAD-MSCs,这些细胞具有典型的间充质细胞形态及干细胞表型,具有多向分化能力。2.胚胎后肾组织微环境可诱导hAD-MSCs向肾系细胞分化,并调控后肾发育相关基因的表达。3.通过添加诱导因子的方法,在体外建立了hAD-MSCs向肾系细胞定向诱导分化的体系。

关键词：人脂肪间充质干细胞肾脏细胞共培养条件培养基诱导因子

以脂肪间充质干细胞为种子细胞构建组织工程脂肪的实验研究

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以脂肪间充质干细胞为种子细胞构建组织工程脂肪的实验研究

作者：李春明兰州大学

学位级别：硕士

目前软组织缺损应用的填充材料最广泛的是固体硅胶和自体脂肪颗粒移植，其中后者由于效果好，来源丰富，无排异反应，但其吸收率高达60-70％，如何克服其不足，则在每年众多的隆乳术和软组织填充术中，使用具有生命力的脂肪组织作填充... 详细信息

目前软组织缺损应用的填充材料最广泛的是固体硅胶和自体脂肪颗粒移植，其中后者由于效果好，来源丰富，无排异反应，但其吸收率高达60-70％，如何克服其不足，则在每年众多的隆乳术和软组织填充术中，使用具有生命力的脂肪组织作填充物是最好的选择。组织工程学的发展为其带来新的希望。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发能够修复，维持或改善损伤组织形态和功能的生物替代物的一门科学。组织工程化脂肪是利用组织工程技术，将具有活性的脂肪细胞种植于可降解的支架上，制造出一种与受体组织相容性好、无免疫原性、有活力、耐久性长、可塑性强的人工脂肪。这种理想的脂肪具有自我修复能力，能为正在成长的患者提供增长能力，从而提高移植脂肪的长期疗效。组织工程学的发展为组织带来了新希望，同时为新型整形美容专业充填材料的开发和改进指明了方向。组织工程技术包括：种子细胞的获取，种子细胞均匀种植于三维支架，形成细胞—支架复合物，共同进行培养，组织工程脂肪的体外构建及动物在体实验观察，本实验将脂肪间充质干细胞经成脂诱导后种植于PLGA三维支架，形成脂肪细胞—可降解三维支架复合物，构建组织工程脂肪，并作为填充材料移植于兔背部皮下组织。在不同时间点，从大体、组织染色及扫描电镜观察组织工程脂肪的形成情况。目的：1．了解体外培养的人脂肪间充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力。2．研究低温冻存对人脂肪间充质干细胞其牛物学特性的影响，探讨MSCs理想的保存方法。3．本研究在分离纯化、大量扩增人脂肪间充质干细胞的基础上，通过冻存后鉴定其生物学特性有无变化，以探讨这种冷冻方法的可行性。4．研究人脂肪间充质干细胞在可降解骨基质材料聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)上的黏附、增殖和分化能力，为进一步体内回植提供研究基础。5．研究以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料的可行性。方法：1．体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数，行成骨和成脂诱导，流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子。2．体外分离培养、扩增正常成人脂肪间充质干细胞在5％DMSO-30％FBS-DMEM冻存保护剂条件下，采用二步法低温保存3月，以台盼蓝拒染回收率(TBR)、ADSCs生长曲线、ADSCs表面抗原表达以及其多向分化能力检测，比较冻存对ADSCs生物学特性的影响。3．用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞，消化细胞并洗涤离心加入10％二甲基亚砜、30％胎牛血清、60％MEM的细胞冻存体系，直接放入-70％冰箱贮存。冻存4、8和12周在37℃水浴复温，通过检测细胞周期、细胞表型和成脂的多向分化潜能，4．等比混合聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)，有机溶剂注模法制备PLGA。体外培养人脂肪间充质干细胞，复合PLGA，通过扫描电镜观察人脂肪间充质干细胞在PLGA上的黏附、增殖，以及在成脂诱导情况下细胞形态的变化。5．实验组：取兔的脂肪间充质干细胞，行体外扩增培养第3代，达到一定数量后成脂诱导1周，接种于PLGA支架上，继续诱导1周，置于兔背部肩胛骨两侧皮下，分别于4、8周从大体和组织学方面观察脂肪形成情况;对照组：单纯以未接种细胞的支架移植于兔背部肩胛骨两侧皮下，于相同时间点进行检测。结果：1．人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CD106，而CD49d、CD34、CD45和HLA-DR表达阴性。细胞周期分析表明：G／G、S和G／M所占比例分别为79.1％、19.7％和1.3％。分离细胞在诱导体系下可以向成骨和成脂方向分化。2．冻存后ADSCs的增殖能力和向成骨细胞、脂肪细胞分化没有显著影响，与冻存前比较，P＞0.05。3．消化后不经过传统的程序性降温冻存技术，直接-70℃冰箱贮存，其细胞生物学特性无明显改变，细胞仍存在成脂的多向分化潜能。4．合成的PLGA呈多孔状，孔隙率为85％，孔径为100～400um。人脂肪间充质干细胞可在PLGA上黏附、增殖、分泌胞外基质，并可在成脂诱导剂的作用下分化为圆形的成脂样细胞。复合后14天，人脂肪间充质干细胞和胞外基质已将基质材料颗粒完全覆盖。5．实验组植入4周后该复合物在支架中有脂肪形成，并可见细胞突入支架材料中;8周后支架材料继续降解，脂肪组织形成明显，伴有少量血管长入。对照组支架材料逐渐崩解，未见脂肪组织形成。结论：1．脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点，体外能够向成骨和成脂方向分化。2．采用5％DMSO-30％FBS-DMEM冻存保护液和二步法的冻存体系，可较完整保持ADSCs生物学特性，是深低温保存ADSCs的理想方案。3．人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生物学特性，是冷冻保存一种可行的方法。4．人脂肪间充质干细胞能在PLGA上粘附、增殖，PLGA可作为人脂肪间充质干细胞的载体和组织工程的支架材料。5．以PLGA为支架材料形成的脂肪为组织工程作为软组织填充材料提供了一个好的思路。

关键词：人脂肪间充质干细胞分化脂肪细胞成骨细胞支架材料扫描电镜组织工程脂肪 PLGA 填充物冷冻贮存

基于自组装纳米多肽及脂肪间充质干细胞3D打印组织模型的研究

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基于自组装纳米多肽及脂肪间充质干细胞3D打印组织模型的研究

作者：周冠洲山东大学

学位级别：硕士

研究背景我们可以在多种组织中找到间充质干细胞,它是一种拥有多向分化潜能的多功能干细胞,其具有容易分离扩增、多向分化和低免疫原性等特性。研究发现脂肪来源的间充质干细胞(Ad-MSCs)相对于其他干细胞,具有来源充足,取材方便,低创即... 详细信息

研究背景我们可以在多种组织中找到间充质干细胞,它是一种拥有多向分化潜能的多功能干细胞,其具有容易分离扩增、多向分化和低免疫原性等特性。研究发现脂肪来源的间充质干细胞(Ad-MSCs)相对于其他干细胞,具有来源充足,取材方便,低创即得,易分离培养,生物学性状稳定等特征,因此研究者普遍认为其在组织工程学和再生医学中是一种更为理想的种子细胞。构成组织工程学支架的材料需要具备良好的生物相容性,较强可塑性,抗张强度大和无免疫原性等特点。目前制备支架的常用材料包括胶原蛋白酶、聚乳酸、海藻酸盐等材料。但这些生物材料都其相应的局限性,现实实验条件下对这些生物材料进行可控研究难度较大。近年来,以多肽为基本组成结构单元,依靠纳米多肽分子自组装得到的纳米组织工程学框架材料已成为组织工程领域新的研究热点,这类纳米多肽生物材料具有良好的生物兼容性、降解性,且最为突出的优点是其具有生物活性。随着3D打印技术的兴起和快速发展,3D打印已开始广泛应用于医学领域,为精准化、个性化医疗提供条件,现阶段对组织工程学高精密度打印也已进入深入的探索和研究。以自组装多肽纳米溶液负载Ad-MSCs为"生物墨汁"利用3D生物打印技术打印出三维结构,通过体外培养3D打印模型内的Ad-MSCs,并给予不同诱导分化条件,观察其内细胞的生长状态及分化程度,研究功能性自组装纳米多肽作为负载Ad-MSCs的3D打印材料的可行性,探寻3D打印新的发展方向。研究目的本实验岂在研究以自组装纳米多肽与人脂肪间充质干细胞(Ad-MSCs)为"生物墨汁",利用3D打印技术,制造组织工程学模型,观察其内细胞生长状态及多向分化能力。希望借此找到新的组织工程学材料。研究方法1.分离、培养原代Ad-MSCs,传代至P2、P3后用于后续实验;使用流式细胞仪对细胞进行细胞免疫表型鉴定并软件分析;对细胞进行鬼笔环肽染色,观察细胞微丝形态;对细胞分别成内皮、成骨、成脂诱导分化,并进行鉴定。2.用10%蔗糖-去离子水溶液溶解三种多肽(RADA16-I、RGD、KLT),分别按所需浓度和体积比混合并原子力显微镜(Olympus公司)观察;将混合溶液放入Transwell成胶,成胶后进行扫描电镜观察;将三种多肽与细胞混合并成胶后进行培养,并观察多肽内细胞形态和生长状态。3.以自组装纳米多肽、Ad-MSCs混合溶液为"生物墨汁"利用3D生物打印技术打印组织工程学模型:打印后切片进行鬼笔环肽荧光染色并观察;诱导3D模型中的Ad-MSCs成骨和成脂分化,诱导完成后分别进行茜素红S、油红0染色,并与对比组进行染色比较。研究结果1.倒置相差显微镜下可见Ad-MSCs为梭形,整体呈现出漩涡状生长趋势;流式细胞仪鉴定可见分离、培养的细胞CD166,CD90,CD29表达阳性,不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR,符合Ad-MSCs免疫表型。鬼笔环肽染色后可见细胞内微丝结构;成骨、成脂诱导分化后可见细胞内出现相关染色剂着色现象。2.原子力显微镜观察纳米多肽溶液,可见其内有纳米纤维结构;纳米多肽水凝胶无色透明,含水量丰富;扫描电镜观察水凝胶,见其内纳米纤维结构并有孔隙;细胞与水凝胶混合成胶并培养后观察可见其内细胞排列紧密,生长状态良好。3.利用"生物墨汁"打印出组织工程模型,切片染色后可见其内的细胞生长状态良好,贴壁紧密。对模型内的Ad-MSCs进行诱导分化,并分别对实验组和对照组进行相关染色,茜素红S染色可见成骨诱导实验组中钙结节形成,油红0染色可见成脂诱导实验组Ad-MSCs内脂滴着色,两对照组不着色。结论以自组装纳米多肽、脂肪间充质干细胞混合溶液为"生物墨汁" 3D打印出的组织工程学模型内Ad-MSCs生长状态良好,仍具有较强的分化能力。

关键词： 3D生物打印功能性自组装纳米多肽人脂肪间充质干细胞组织工程学