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胰十二指肠同源盒基因-1在人脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞中的作用

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胰十二指肠同源盒基因-1在人脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞...

作者：白国立青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨胰十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)在人脂肪间充质干细胞(h ADSC)分化为胰岛分泌细胞中的作用。方法将冻存的人脂肪间充质干细胞进行复苏,并随机分为实验组与对照组,实验组:将携带胰十二指肠同源盒基因-1的病毒液(MOI(感染复数)=50... 详细信息

目的探讨胰十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)在人脂肪间充质干细胞(h ADSC)分化为胰岛分泌细胞中的作用。方法将冻存的人脂肪间充质干细胞进行复苏,并随机分为实验组与对照组,实验组:将携带胰十二指肠同源盒基因-1的病毒液(MOI(感染复数)=50)加入细胞悬液中,混合培养4小时后,去除含有病毒的培养液,更换新鲜的完全培养液,继续培养至48小时,以保证转染效果;对照组:采用不含病毒液的培养液培养48小时。然后分别采用蛋白质印迹法(Western-blotting)和细胞免疫荧光染色方法对感染结果进行检测。对感染后15天细胞利用双硫腙(DTZ)染色观察胰岛素阳性反应细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞胰岛素的分泌量,细胞免疫荧光染色法检测胰岛分泌相关基因insulin 1的表达。结果(1)实验组的人脂肪间充质干细胞进行病毒感染48h后,Western blot法和免疫荧光法均可检测到PDX-1的表达,对照组的细胞则无PDX-1的表达,并且感染的细胞在15d之后仍能检测到PDX-1的表达。(2)实验组出现胰岛素阳性细胞且被染成棕红色,对照组未出现胰岛素阳性细胞。(3)感染后15d,实验组和对照组细胞在低糖环境下分泌的胰岛素量分别为(6.98±0.72)、(6.78±0.54)ng/m L,两组比较,P>0.05,无统计学意义;高糖环境下分泌的胰岛素量分别为(13.38±0.66)、(6.50±0.64)ng/m L,两组比较,P人脂肪间充质干细胞向胰岛分泌细胞分化过程中具有促进作用,对开展胰岛移植治疗I型糖尿病具有重要意义。

关键词：胰十二指肠同源盒基因-1 人脂肪间充质干细胞腺病毒基因转染胰岛分泌细胞

Notch信号通路调控人脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的研究

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Notch信号通路调控人脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的研究

作者：黄清江遵义医学院

学位级别：硕士

目的:用VEGF165诱导人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,h ADSCs)向内皮细胞分化,通过γ-内分泌酶抑制剂(DAPT)对诱导分化进行干预,检测细胞的分化程度、Notch信号的表达、细胞迁移能力及成血管能力的变... 详细信息

目的:用VEGF165诱导人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,h ADSCs)向内皮细胞分化,通过γ-内分泌酶抑制剂(DAPT)对诱导分化进行干预,检测细胞的分化程度、Notch信号的表达、细胞迁移能力及成血管能力的变化,探究Notch信号通路在VEGF所诱导的h ADSCs向内皮细胞分化中的作用。方法:1、脂肪组织来源于遵义医学院附属医院整形外科住院的3例患者,经病人同意并签署知情同意书后,手术室无菌条件下收集标本,采取器械剪切、酶消化及离心法提取h ADSCs,用含胎牛血清的DMEM培养基培养细胞并传代,倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标志CD29、CD31、CD34及CD44的表达;取传代至第3代的h ADSCs,用VEGF165诱导其向内皮细胞分化,14天后流式检测内皮细胞表面抗原的表达。2、取传代至第3代的h ADSCs分为2组:对照组:h ADSCs;诱导组:h ADSCs+50ng/m L的VEGF165。实时荧光定量PCR法及Western bolt电泳法检测两组细胞培养至7天及14天时Notch1,Notch14及Dll4的m RNA和蛋白的表达。3、取传代至第3代的h ADSCs分为3组:对照组:传至第三代的h ADSCs;诱导组:h ADSCs+VEGF165(50ng/m L);干预组:VEGF165(50ng/m L)+h ADSCs+DAPT(三个不同浓度2.5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml);各组细胞培养至7天及14天后,分别用流式细胞仪检测内皮细胞表面特异性抗原VE cadherin和CD31表达程度。用Transwell小室检测上述细胞的细胞迁移能力。4、取传代至第3代的h ADSCs分为3组,分组及处理情况同细胞迁移实验,将上述三组细胞培养至7天和14天后,分别取约2×104个细胞移植于铺好Matrigel基质胶中的96孔板上,37℃培养箱中孵育6h后显微镜拍照并分析体外血管生成能力。5、取传代至第3代的h ADSCs分为3组,分组及处理情况同细胞迁移实验,将上述三组细胞分别培养7天后,取各组对应的新的细胞培养液和融化的Matrigel基质胶混合,再与三组细胞分别混匀,植入裸鼠侧肋部皮下,7天后颈椎脱臼处死裸鼠并取出种植的Matrigel胶,观察胶内血管生成情况,切片做CD31免疫化学染色,分析体内血管生成能力。结果:1、从人的脂肪组织中分离出间充质干细胞,细胞形态多为梭形或星形,呈放射集落样生长。流式细胞仪检测细胞表型分析表明,传至第三代的脂肪间充质干细胞表型CD29(96.31%)、CD44(98.91%)呈阳性表达,内皮细胞表型CD31、CD34阴性表达;向内皮细胞诱导14天后CD31(88.38%)、CD34(92.81%)均呈阳性表达,而CD29、CD44的阳性表达率降低。2、q PCR结果显示:对照组和诱导组的细胞中Notch1、Notch4及Dll4的m RNA均有表达,诱导组的相对表达量高于对照组,诱导组中诱导14天的相对表达量比7天的表达高,差异均有统计学意义(P细胞中Notch1、Notch4及Dll4的蛋白均有表达,诱导组的蛋白相对表达量高于对照组,诱导组中14天的相对表达量比7天的表达高,差异均有统计学意义(P细胞表面特异性抗原VE-cadherin和CD31的阳性率的趋势相同;对照组阳性率最低,均低于1%;诱导组和干预组中14天的阳性率高于7天组;诱导组阳性率高于干预组;干预组中低浓度DAPT组的阳性率高于高浓度DAPT组,差异有统计学意义(P细胞迁移实验中,诱导组的细胞迁移能力最强,干预组次之,对照组细胞迁移能力最弱;诱导组和干预组中14天的细胞迁移能力较7天强,干预组中低浓度DAPT组的细胞迁移能力较高浓度组的迁移能力强,差异有统计学意义(P细胞间成分离状态,未见血管形成;诱导组可见形成闭合的多边形结构或形成复杂的网状结构;干预组中见较多细胞排列呈线,或少数形成网状结构。诱导组的血管生成能力强于干预组;干预组中低浓度DAPT组的血管生成能力较高浓度组强,差异均有统计学意义(P细胞在裸鼠体内血管生成能力的强弱关系与体外血管生成实验结果一致,CD31免疫化学染色见形成的管腔内壁有内皮细胞着色,证实所成管网为血管网;诱导组有大量管腔形成,干预组形成的管腔数少于诱导组,(P细胞分化过程中,VEGF能上调Notch信号通路的表达

关键词：人脂肪间充质干细胞 Notch信号通路内皮细胞血管内皮生长因子

CD73+人脂肪间充质干细胞治疗难治压疮的疗效评价与机制探讨

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CD73+人脂肪间充质干细胞治疗难治压疮的疗效评价与机制探讨

作者：李盟新乡医学院

学位级别：硕士

背景压力性损伤（Pressure injury）又称压疮、褥疮,是临床常见并发症,其发生率高、难治愈,是护理工作的一大难题。难治性压疮多见于3、4期压疮,因皮肤全层破溃、炎症及窦道形成等,易并骨髓炎和骨坏死,更成为临床治疗难点。目前细胞治... 详细信息

背景压力性损伤（Pressure injury）又称压疮、褥疮,是临床常见并发症,其发生率高、难治愈,是护理工作的一大难题。难治性压疮多见于3、4期压疮,因皮肤全层破溃、炎症及窦道形成等,易并骨髓炎和骨坏死,更成为临床治疗难点。目前细胞治疗为难治性压疮提供新方向。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）具有多向分化、免疫抑制、分泌因子等等生物学特性,已成为慢性创面治疗中极有前景干细胞之一。MSCs是非均质细胞群,由多种具有不同生物学特性的亚群细胞组成,寻找治疗难治性压疮的优势亚群,具有较大临床意义。因脂肪间充质干细胞（Adipose mesenchymal derived stem cells,ADMSCs）在体外易扩增和取材,伦理问题少等优势,在临床治疗中应用较广泛。CD73,一种外生-5’-核苷酸酶,定于细胞膜上的糖蛋白,具有核苷酶活性和信号传导功能。目前,CD73分子已用于多种疾病的治疗,如肿瘤、心肌损伤、器官移植等。评价CD73+ADMSCs治疗压疮的疗效,并全面分析其作用机制,可为临床开发CD73+细胞提供理论依据,进而为干细胞治疗压疮提供筛选细胞的分子标准。目的评价CD73+ADMSCs治疗小鼠压疮疗效,剖析CD73在ADMSCs促进难治性压疮创面修复机制。方法1.体外培养人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）。2.干扰ADMSCs的CD73表达和抑制ADMSCs的CD73活性。构建GFP标记的CD73干扰慢病毒载体,转染ADMSCs,抑制CD73表达,用Western Bloting和Realtime PCR检测转染效率。使用CD73活性抑制剂5’-α,β-亚甲基二磷酸（APCP）,抑制其活性。3.将ADMSCs接种于6孔板,实验分组:培养基对照组（Media Only）、空白对照组（ADMSCs组）、底物对照组（ADMSCs+AMP组）、CD73活性抑制组（ADMSCs+APCP+AMP 组）、慢病毒对照组（ADMSCs+LV+AMP）和 CD73 表达抑制组（ADMSCs+CD73siRNA+AMP组）,液相色谱质谱仪检测细胞上清腺苷（ADO）含量。4.将8周龄的小鼠用磁片加压36h制备压疮模型,随机分为模型组（NC）、ADMSCs移植组、CD73活性抑制组（ADMSCs+APCP）、空病毒对照组（ADMSCs+LV）和CD73表达抑制组（ADMSCs+CD73siRNA）,每组8只。采用多点注射1×106个（100μL）细胞治疗,NC组予等量PBS。5.治疗后3d、7d、14d,体视显微镜拍摄创面,计算创面愈合率;HE染色观察形态、炎细胞浸润和血管新生;免疫组化测压疮及周围CD31和VEGF表达;用Realtime PCR 检测组织 IL-10 和 TNF-α 表达。结果1.ADMSCs呈长梭形、多角形。病毒转染72 h,ADMSCs高表达GFP,ADMSCs+CD73siRNA组的CD73基因和蛋白较ADMSCs+LV组低,差异具有统计学意义（P＜0.001）。2.与ADMSCs+AMP组比较,ADMSCs+APCP+AMP组的腺苷含量低但高于ADMSCs组,差异具有统计学意义（P＜0.001）,与ADMSCs+LV+AMP相比,ADMSCs+CD73siRNA+AMP组上清液中腺苷含量低,差异具有统计学意义（P＜0.001）。3.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组愈合率高于NC组和ADMSCs+APCP组,有统计学差异（P＜0.05）;与ADMSCs+LV组比,ADMSCs+CD73siRNA低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组CD31、VEGF免疫组化染色平均灰度值大于ADMSCs+APCP组,NC组最低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;ADMSCs+LV组平均灰度值高于ADMSCs+CD73siRNA组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。5.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组TNF-α mRNA的相对表达量低于ADMSCs+APCP组,NC组最高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与ADMSCs+LV组比,ADMSCs+CD73siRNA组高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。ADMSCs组IL-10mRNA的相对表达量高于ADMSCs+APCP组,NC组最低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与ADMSCs+LV组比ADMSCs+CD73siRNA组低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.应用CD73+ADMSCs可促进创面愈合,抑制ADMSCs表面CD73的表达或活性均会减缓愈合。2.CD73促创面高表达VEGF和CD31,加快局部血管新生,可能是其治疗难治性压疮的机制之一。3.CD73促创面高表达IL-10、低表达TNF-α,CD73+ADMSCs可能通过CD73/腺苷轴调控创面免疫

关键词： CD73 VEGF 腺苷人脂肪间充质干细胞压疮

不同冻存条件对人脂肪间充质干细胞表型及成瘤性的影响

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不同冻存条件对人脂肪间充质干细胞表型及成瘤性的影响

作者：王嘉玲四川大学

学位级别：硕士

背景:人脂肪间充质干细胞(human adipose tissue-derives mesenchymal stem cells,hADSCs)是从人脂肪组织中分离出的具有干细胞特性的细胞群,具有极强的体外扩增能力和多向分化潜能。因其来源充分、易于分离培养,免疫原性低,具有广阔的... 详细信息

背景:人脂肪间充质干细胞(human adipose tissue-derives mesenchymal stem cells,hADSCs)是从人脂肪组织中分离出的具有干细胞特性的细胞群,具有极强的体外扩增能力和多向分化潜能。因其来源充分、易于分离培养,免疫原性低,具有广阔的基础研究及临床应用前景,为细胞治疗、科学研究及临床应用提供新的细胞来源。但是从人体中获得的干细胞有限,达不到临床使用的数量,因此需要在体外扩增到一定的数量。经体外扩增后,干细胞需低温冻存,以便细胞的储存、运输,进而用于未来的干细胞治疗。目前冻存常用的冻存液含有二甲基亚砜(DMSO),其可在冻存过程中防止细胞内冰晶的形成,从而保护细胞免受低温损伤。但是DMSO本身是具有细胞毒性。有研究发现,由于其潜在的毒性,将低剂量的DMSO注入动物模型体内会产生不良反应,包括恶心、头痛、血压不稳定、腹泻等症状。甚至有研究表明,DMSO可能会改变染色体的稳定性,从而导致肿瘤的形成。出于安全性的考虑,越来越多的研究开始使用不含DMSO(DMSO-FREE)的冻存液。为了探究使用DMSO-FREE冻存液冻存的hADSCs是否更安全,于是我们对冻存后hADSCs的干细胞干性特征如表型、分化潜能及成瘤性进行了研究。有研究报道,干细胞在长期培养下可能出现基因组突变,但是不会发生恶性转变。而经过不同冻存条件冻存后,即使用含DMSO的冻存液或DMSO-FREE冻存液后,长期培养的hADSCs是否会发生恶性转变呢?于是我们对使用含DMSO的冻存液或DMSO-FREE冻存液后,长期培养的hADSCs进行了干细胞干性特征和成瘤性的研究。目的:本研究旨在探索,在不同冻存条件下,即使用含DMSO的冻存液或DMSO-FREE冻存液时,hADSCs的表型和成瘤性会发生怎样的变化。以及使用含DMSO的冻存液或DMSO-FREE冻存液冻存hADSCs后,细胞长期培养时表型和成瘤性的变化。材料和方法:1.培养hADSCs至P3代,通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面抗原的表达(干细胞阳性抗原CD73、CD90、CD105、CD44、CD29,干细胞阴性抗原CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR)以及通过“三向分化”诱导实验(诱导成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞),对hADSCs进行鉴定。2.使用含有DMSO的冻存液或DMSO-FREE的冻存液对hADSCs进行为期2-3周的液氮低温冻存。对冻存后hADSCs进行复苏,使用7-氨基放线菌素(7-AAD)对hADSCs进行流式细胞术检测,检测细胞经过不同冻存液冻存后的存活率。3.对冻存后hADSCs的细胞形态进行观察,使用流式细胞术检测表面抗原的表达,以及进行“三向分化”诱导,确定hADSCs在冻存后表型是否发生变化以及干细胞干性是否发生变化。4.对冻存后hADSCs的成瘤性进行检测,在体内,通过裸鼠皮下移植实验检测冻存后hADSCs是否具有成瘤性;在体外,通过qRT-PCR检测细胞中原癌基因(C-myc)和抑癌基因(P53、RB1)的表达情况。5.对冻存后的hADSCs进行长期传代培养至P10代,通过观察细胞形态,使用流式细胞术检测表面抗原的表达,以及进行“三向分化”诱导,确定hADSCs在冻存后长期培养的情况下,细胞表型以及干细胞干性是否发生变化。6.对冻存后hADSCs长期培养至P10代的细胞成瘤性进行检测,在体内,通过裸鼠皮下移植实验检测冻存后hADSCs是否具有成瘤性;在体外,通过qRT-PCR检测原癌基因(C-myc)和抑癌基因(P53、RB1)的表达情况。结果:1.培养的P3代的hADSCs贴壁生长,呈梭形形态,符合hADSCs的形态;流式细胞术结果显示,P3代的hADSCs高表达CD73、CD90、CD105、CD44、CD29,且低表达CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR;“三向分化”实验表明,P3代的hADSCs可以在成脂、成骨、成软骨诱导培养基的作用下,被诱导成为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞。以上结果说明,培养的hADSCs纯度高,满足实验研究要求。2.P3代的h ADSC经过含DMSO冻存液或DMSO-FREE冻存液冻存后,使用7-AAD抗体孵育,通过流式细胞术可以观察到,经含DMSO冻存的hADSCs存活率明显高于经DMSO-FREE冻存的hADSCs。3.P3代的hADSCs经过含DMSO冻存液或DMSO-FREE冻存液冻存后,复苏传代培养发现,细胞都呈贴壁生长,细胞形态都呈梭形;流式细胞术结果显示,细胞都高表达CD73、CD90、CD105、CD44、CD29,且都低表达CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR;“三向分化”实验表明,细胞都可以在成脂、成骨、成软骨诱导培养基的作用下,被诱导成为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞。以上结果说明,hADSCs经过含DMSO冻存液或DMSO-FRE

关键词：人脂肪间充质干细胞冻存二甲基亚砜表型成瘤性

CD73+人脂肪间充质干细胞通过CD73/腺苷轴促进心肌修复

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CD73+人脂肪间充质干细胞通过CD73/腺苷轴促进心肌修复

作者：李苗苗新乡医学院

学位级别：硕士

背景心肌梗死（myocardial infarction,MI）可导致大量的心肌细胞死亡和心室重塑。由于心肌再生能力十分有限,细胞移植疗法为心脏疾病治疗带来新的曙光。目前间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是细胞治疗研究热点。CD73、CD... 详细信息

背景心肌梗死（myocardial infarction,MI）可导致大量的心肌细胞死亡和心室重塑。由于心肌再生能力十分有限,细胞移植疗法为心脏疾病治疗带来新的曙光。目前间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是细胞治疗研究热点。CD73、CD105和CD90是MSCs显性标记分子,但CD73分子在心肌损伤细胞治疗中的作用鲜有报道。细胞移植治疗心肌损伤时不仅关注于细胞替代和内分泌机制,同时应当高度重视移植细胞对心肌微环境的免疫调控作用。CD73+脂肪间充质干细胞（adiposetissue derived mesenchymal stem cells,ADMSCs）治疗心肌梗死是否参与了免疫调控?亟待我们探讨,全面分析CD73+ADMSCs治疗心肌损伤的机制,为临床开发利用CD73+细胞提供理论和实验依据,给MSCs治疗心肌损伤等疾病提供筛选细胞的分子参考标准。目的1.探讨人ADMSCs治疗心肌损伤时是否存在CD73/腺苷轴。2.评价CD73+ADMSCs移植治疗心肌梗死的疗效,探讨人ADMSCs是否通过CD73/腺苷轴发挥免疫调控作用促进梗死心肌修复。方法1.流式细胞术检测ADMSCs表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD45的表达。2.构建CD73si RNA干扰载体转染ADMSCs,Western blotting和Real-time PCR检测CD73的表达,使用CD73抑制剂腺苷5’-α,β-亚甲基二磷酸（adenosine-5’-α,β-methylene diphosphate,APCP）抑制CD73活性。ADMSCs接种于6孔板,加入5’-单磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate,AMP）底物,实验分组:单纯培养基组（Media Only组）、空白对照组（ADMSCs组）、底物对照组（ADMSCs+AMP组）、CD73活性抑制组（ADMSCs+APCP+AMP组）、慢病毒对照组（ADMSCs+LV+AMP组）和CD73表达抑制组（ADMSCs+CD73si RNA+AMP组）,液相色谱质谱仪（liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS）检测各组细胞上清中腺苷含量。3.制备大鼠心肌梗死模型,采用多普勒超声和心电图检测。心梗区域多点注射移植细胞,分为假手术组（Sham组）、心肌梗死模型组（MI组）、ADMSCs移植组（MI+ADMSCs组）、CD73活性抑制组（MI+ADMSCs+APCP组）、慢病毒对照组（MI+ADMSCs+LV组）、CD73表达干扰组（MI+ADMSCs+CD73si RNA组）。第1d和3d,使用液相色谱质谱仪和二甲苯酚橙分别检测心肌梗死区域的腺苷含量与过氧化氢含量。多普勒超声检测各组第1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d的左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular short axis shortening rate,LVFS）和左心室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volume,LVESV）。利用Real-time PCR检测移植区域14d和28d心肌组织中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）的表达。结果1.ADMSCs高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,低表达CD45。2.CD73si RNA转染ADMSCs后,CD73蛋白与基因表达均下降（P＜0.001）。体外腺苷检测结果显示:ADMSCs+AMP组、ADMSCs+APCP+AMP组和ADMSCs组腺苷量依次降低,组间比较（P＜0.001）;ADMSCs+LV+AMP组高于ADMSCs+CD73si RNA+AMP组（P＜0.001）。3.体内腺苷结果显示:各组细胞移植1 d,MI+ADMSCs组高于MI组和MI+ADM SC s+AP CP组（P＜0.0 01）;MI+ADM SC s+LV组、MI组和MI+ADMSCs+CD73si RNA组腺苷量依次降低,组间比较（P＜0.001）。各组细胞移植3d,MI+ADMSCs组高于MI组（P＜0.001）和MI+ADMSCs+APCP组（P＜0.05）;MI+ADMSCs+LV组高于MI组（P＜0.001）和MI+ADMSCs+CD73si RNA组（P＜0.05）。4.MI与Sham相比,心电图ST段弓背抬高。多普勒超声结果显示:心梗后细胞移植1d-28d,MI组LVEF和LVFS低于Sham组,LVESV高于Sham组（P＜0.05）。MI+ADMSCs组和MI+A

关键词： CD73 腺苷心肌梗死心肌修复人脂肪间充质干细胞

Toll样受体预活化的人脂肪间充质干细胞对人肺癌H460细胞生长的抑制作用

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中国生物制品学杂志 2021年第6期34卷 657-665页

作者：邓颖珊杜晶春徐霞谢闺娥林雪霏赖斯华广州医科大学金域检验学院广东广州510182

目的观察聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid,简称为Poly(I∶C)]和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)预活化后的人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADMSCs)对人肺癌H460细胞生长的抑制作用。方法利用抽脂手术遗弃脂肪组织标本制备hADMSCs,并鉴定其细胞表面分子标志、细胞增殖能力和体外分化能力;比较Poly(I∶C)、LPS预活化后的hADMSCs细胞表面标志和体外分化能力;ELISA法测定Poly(I∶C)、LPS预活化后的hADMSCs培养基上清中IFNβ的分泌情况;Western blot法分析Poly(I∶C)预活化后的hADMSCs TRAIL的表达情况;用不同浓度Poly(I∶C)预活化hADMSCs后,与不同比例的H460共培养,分析对肿瘤细胞的抑制作用。结果光学显微镜下hADMSCs呈纤维样、鱼群样排列;hADMSCs细胞表面标志CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC的阳性率均大于95%,造血干细胞的特异性标志物CD34、CD45的阴性率均大于98%;Poly(I∶C)和LPS刺激的hADMSCs其细胞表面标志未受影响。Poly(I∶C)和LPS能促进hADMSCs的成骨分化,对成脂分化能力无明显作用。经Poly(I∶C)诱导的hADMSCs分泌的IFNβ浓度明显高于未经诱导的对照组(P细胞表现出细胞毒性,对H460细胞的生长有抑制作用;hADMSCs∶H460比例为1∶2时,对H460细胞的抑制效果最佳。结论成功分离、培养出hADMSCs,其在体外低浓度的Poly(I∶C)诱导下能表达TRAIL,并对H460细胞的生长产生抑制作用。

关键词：人脂肪间充质干细胞聚肌胞苷酸脂多糖 H460细胞

三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力

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中国组织工程研究 2024年第25期28卷 4022-4026页

作者：刘伟蒋洪宇陈嘉杰高宇阳管延军贾志博焦颖华真蒋格涵何莹汪爱媛彭江亓建洪山东第一医科大学(山东省医学科学院)运动医学与康复学院山东省泰安市271000 解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所北京市100853

背景:与传统二维培养相比,三维培养软骨微组织具有更大的优势,但仍需进一步探索更有利的三维培养方式。目的:评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力。方法:通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体,采用DN... 详细信息

背景:与传统二维培养相比,三维培养软骨微组织具有更大的优势,但仍需进一步探索更有利的三维培养方式。目的:评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力。方法:通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体,采用DNA定量和核染色验证脱细胞是否成功,通过组织学染色观察脱细胞前后基质保留情况,采用扫描电子显微镜和CCK-8方法对微载体进行表征;通过三维静态培养法和三维动态培养法将软骨源性微载体与人脂肪间充质干细胞结合构建软骨源性微组织,利用扫描电子显微镜、活死染色、RT-qPCR等手段检测两组微组织的细胞活力及成软骨能力。结果与结论:①成功制备软骨源性微载体,与脱细胞前相比,脱细胞后DNA含量显著降低(P细胞外基质特征;CCK-8法检测表明微载体无细胞毒性且能够促进细胞增殖;②扫描电子显微镜及活死染色结果显示,相比三维静态组,三维动态组微组织细胞具有更舒展的形态,细胞与细胞间、细胞与基质间、基质与基质间形成广泛的连接;③RT-qPCR结果表明两组微组织SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达在培养7 d或14 d时均增高;14 d时三维动态组各基因相对表达量均显著高于三维静态组(P细胞活性和成软骨能力。

关键词：关节软骨损伤组织工程人脂肪间充质干细胞微组织三维动态培养

甘草中5种活性物质对人脂肪间充质干细胞的抗衰老作用

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同济大学学报（医学版） 2021年第2期42卷 179-186页

作者：降瑞婵刘海亮石河子大学生命科学学院新疆植物药资源利用教育部重点实验室新疆石河子832003 同济大学附属东方医院再生医学研究所上海200123 同济大学附属东方医院干细胞转化医学产业基地上海200123

目的研究甘草中5种活性物质甘草酸(GA)、甘草苷(LQ)、异甘草苷(ILQ)、芹糖甘草苷(LA)和芹糖异甘草苷(ILA)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)抗衰老效果。方法用CCK-8法测定不同浓度甘草5种活性物质对hAD... 详细信息

目的研究甘草中5种活性物质甘草酸(GA)、甘草苷(LQ)、异甘草苷(ILQ)、芹糖甘草苷(LA)和芹糖异甘草苷(ILA)对人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)抗衰老效果。方法用CCK-8法测定不同浓度甘草5种活性物质对hADSCs增殖的影响,选择5种化合物的适宜浓度对hADSCs进行培养,并用Ki67染色观察其增殖能力;利用细胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase, SA-β-gal)染色法观察细胞衰老情况;用细胞内活性氧类(reactive oxygen species, ROS)试剂盒检测细胞内ROS含量;采用流式细胞仪检测hADSCs细胞周期;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测p16~(INK4a)、p53、p21 mRNA的表达,测定端粒相对长度;对hADSCs进行成脂和成骨诱导培养,并分别利用油红O和茜素红染色观察脂滴和矿化结节。最后对化合物处理后细胞进行测序分析。结果 CCK-8结果显示,甘草酸、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷以及芹糖异甘草苷在hADSCs实验中适宜浓度分别是3.125、3.125、3.125、3.125、6.25μmol/L;在此浓度下,5种活性物质都能使Ki67阳性细胞数目显著增多,使β-半乳糖苷酶阳性数目显著减少;除芹糖甘草苷外能使细胞内ROS水平降低;芹糖异甘草苷能使G_1期细胞比例下降;并且甘草酸、甘草苷和芹糖异甘草苷能使p16~(INK4a)基因表达量下降,能减弱hADSCs成脂分化能力,促进细胞成骨分化能力。结论在甘草酸、甘草苷、异甘草苷、芹糖异甘草苷和芹糖甘草苷5种活性物质中,甘草酸的抗衰老效果最佳,其次是甘草苷和芹糖异甘草苷。

关键词：甘草甘草酸人脂肪间充质干细胞抗衰老

腺病毒与慢病毒载体对人脂肪间充质干细胞转导效率及基因表达的差异

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中国美容医学 2009年第3期18卷 342-345页

作者：李丹乔群王晓军钱建平北京协和医学院北京协和医院整形美容外科北京100032

目的:比较重组腺病毒、慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白对体外培养的人脂肪来源干细胞(hADSCs)的转导效率和外源基因表达差异。方法:原代分离培养hADSCs并鉴定,应用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800感染hADS... 详细信息

目的:比较重组腺病毒、慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白对体外培养的人脂肪来源干细胞(hADSCs)的转导效率和外源基因表达差异。方法:原代分离培养hADSCs并鉴定,应用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800感染hADSCs,在1、3、7、14、21天应用荧光显微镜、流式细胞仪观察检测表达EGFP细胞阳性率。MTT法检测转导对hADSCs增殖的影响。VonKossa染色、油红O染色检测体外诱导转导EGFP的hADSCs向成骨及成脂方向分化能力。结果:hADSCs细胞表面标记CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR阴性,CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166阳性。荧光显微镜观察Ad5F35-EGFP感染hADSCs后(1～7天)可见EGFP高表达,此后逐渐减弱;LV-EGFP感染hADSCs后21天,仍可见EGFP高表达。流式细胞仪检测Ad5F35-EGFP、LV-EGFP对hADSCs转导效率与MOI值呈正相关。MTT显示Ad5F35-EGFP在高MOI值(800)检测A值与对照组相比差异显著(P<0.01)。转导EGFP的hADSCs经体外诱导14天可向成骨、成脂方向分化。结论:与腺病毒相比,慢病毒能够更为安全、有效地感染体外培养hADSCs,并长期表达外源基因,是研究基因修饰hADSCs的理想载体。

关键词：人脂肪间充质干细胞基因治疗腺病毒慢病毒