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运动训练联合hADSCs移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及相关机制的研究

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运动训练联合hADSCs移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及相关机制...

作者：张鑫南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类高致残的中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病。据估计,全球有250余万脊髓损伤患者,每年新发患者超过13万,且多发于青壮年。随着现代医学的发展,SCI后患者的存活... 详细信息

研究背景和目的：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一类高致残的中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病。据估计,全球有250余万脊髓损伤患者,每年新发患者超过13万,且多发于青壮年。随着现代医学的发展,SCI后患者的存活率明显上升,但遗留的后遗症严重影响患者生活质量,降低生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。为治疗SCI人们进行了许多探索,但至今,效果并不理想。随着干细胞领域研究的不断深入,发现干细胞能分化为多个胚层的组织细胞,替代损伤等所带来的细胞缺失,同时能分泌多种营养因子,改善损伤局部的微环境,促进损伤的修复,使得细胞移植治疗成为治疗CNS等系统疾病的一种极具前景的方法。多年来,不同种类的干细胞被研究用于治疗多系统的不同疾病,取得了不同的疗效,但随着研究的深入,干细胞治疗也因伦理问题、增殖分化能力、有成瘤致畸等风险而备受争议。近年,随着研究的深入,人们发现间充质干细胞(mesenchymal stromal cell, MSC)无伦理等相关问题、在体内外有很强的增殖分化能力、同时具有较低的免疫源性,成为细胞移植治疗的理想来源。其中脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs),由于相较于骨髓来源及脐带等来源的MSC,有更强的分化能力,更低的免疫源性,更广的来源,目前被认为是细胞移植治疗SCI的上佳来源。有研究证实,将ADSCs移植治疗SCI相较于骨髓等来源的MSC对减轻损伤,促进损伤后运动、感觉等功能的恢复具有更明显的效果。近来,临床及基础研究证实运动训练对于SCI后运动、感觉等功能的恢复有促进作用和可喜的应用前景。运动训练能提高损伤脊髓组织的可塑性,改善损伤后局部的血液供应,减轻炎症反应、细胞的凋亡,促进中枢神经系统神经营养因子等的表达,促进内源性神经干细胞的迁移分化,对功能的恢复有至关重要的作用。同时相关研究也已证实运动训练还能提高移植细胞的存活能力,对治疗有进一步强化促进作用。随着对SCI后病理生理研究的不断深入,发现SCI后全身及脊髓局部会发生极其复杂的病理生理改变包括神经细胞的凋亡、组织的缺血水肿、炎症细胞的浸润、轴突的断裂、髓鞘的溶解等,且其持续时间根据原发性损伤程度的不同从数月到数年不等。正是由于这种伤后复杂且持续的病理生理变化,使得目前各种单一治疗(细胞移植、运动训练、药物治疗等)的效果十分有限,为此,有研究开始从多方面着手,采取联合治疗来进一步提高治疗效果。相关研究已证实,联合治疗相较于单一治疗能明显改善伤后运动、感觉等功能的恢复。鉴于运动训练能改善脊髓组织的可塑性及局部微环境,促进CNS中营养因子等的表达,提高移植细胞的存活与分化能力;ADSCs移植后能在局部存活、减轻伤后炎症反应、减少细胞的凋亡、减轻胶质瘢痕的生成、促进神经轴突的再生,且目前两者单一治疗对脊髓损伤后神经功能的恢复作用十分有限,我们选择采用联合两者来治疗不完全脊髓损伤,探讨此联合治疗是否能进一步促进伤后运动功能的恢复及相关机制,为临床治疗SCI提供理论依据。方法： 1、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的收集、提取、培养及细胞流式鉴定细胞表面标志、细胞周期检测;荧光双标法检测间充质干细胞相关蛋白：波形蛋白(vimentin)、层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白(fibronetin);采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞体外分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的能力。 2、采用改良的Allen法制作T10不完全脊髓损伤模型,将造模成功的SD大鼠进行分组：联合治疗组、细胞移植组、运动训练组、损伤对照组,以及假手术(只打开椎板,不造成脊髓损伤)。细胞移植组及联合治疗组即刻用Hanmihon微量注射器将鉴定过的浓度为2×105个/μL的101μL细胞沿损伤中心头尾端缓慢注入;运动训练组、损伤对照组及假手术组用同样方法移植等量PBS;联合治疗组及运动训练组在伤后24小时开始行每天30min、每次15min、间隔5min、每周5次的,持续到实验结束的运动训练(跑台训练)。 3、行为学评定：在术前和术后第1、2、3、7、14、21、28天采用Basso, Beattie and Bresnahan(BBB)法对各组大鼠后肢运动功能进行双盲评分。 4、脊髓组织冰冻切片免疫荧光法检测不同时间点、不同组别的脊髓组织中炎症反应(ED1+)、损伤空洞面积(胶质瘢痕面积,GFAP+).轴突(神经丝蛋白(NF-200)、血清素(5-HT))以及用抗人核(anti-human nuclei antibody,hNU)检测细胞存活的情况。 5、提取新鲜脊髓蛋白,采用二辛可宁酸(BCA)法检测脊髓总蛋白含量,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测相同标本的BDNF含量,然后测得不同组别间、不同时间点脊髓组织中

关键词：脊髓损伤人脂肪间充质干细胞运动训练运动功能脑源性神经营养因子脊髓可塑性

慢病毒介导VEGF165感染hADSCs与HUVEC共培养构建工程脂肪修复大鼠软组织缺损的实验研究

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慢病毒介导VEGF165感染hADSCs与HUVEC共培养构建工程脂肪修复大鼠...

作者：刘刚强兰州大学

学位级别：硕士

[目的]：1.探讨携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的最佳条件及其对hADSCs成脂分化能力的影响;2.hADSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立共培养体系,与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性;3.... 详细信息

[目的]：1.探讨携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的最佳条件及其对hADSCs成脂分化能力的影响;2.hADSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立共培养体系,与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性;3.慢病毒介导VEGF165感染hADSCs与HUVEC共培养构建的脂肪组织工程修复大鼠后肢软组织缺损。[方法]：1.从人体正常脂肪组织中提取出脂肪问充质干细胞,体外培养并扩增;行成脂及成骨诱导鉴定脂肪间充质干细胞的多向分化特性,流式细胞仪检测细胞表面分子CD3、CD44、CD45、CD90;在不同的感染复数(MOI)条件下,对hADSCs感染8小时后观察感染效果;流式细胞仪检测感染效率;MTT法检测感染对hADSCs的增殖能力的影响;对感染后的hADSCs 成脂诱导 14d,行油红0染色后,应用Image-Pro Plus图像分析软件比较hADSCs的成脂能力;2.HUVEC的扩增与表面分子CD31、CD34的测定;hADSCs与HUVEC增殖曲线的测定,观察两种细胞按照不同比例共培养时生长情况;将共培养细胞种植于丝素蛋白支架后行电镜扫描观察细胞在支架上的形态;成脂诱导14天后,油红O染色及RT-PCR鉴定共培养组与单纯hADSCs组成脂情况。3.体内实验：选取Wistar大鼠18只,制成后肢软组织缺损模型。实验设计分为三组,Ⅰ组：经VEGF165基因转染的hADSCs与HUVEC构成的共培养体系,Ⅱ组：单纯经VEGF165基因转染的hADSCs,Ⅲ组：为空白对照。分别将两组细胞与多孔丝素蛋白支架联合后,种植于大鼠模型的软组织缺损处,于4w及8w取材,观察构建物在体内的生长情况,并比较湿重,电镜下观察细胞的生长情况;行HE染色观察构建的工程脂肪成脂及血管化情况,油红O染色观察成脂情况。[结果]：1.脂肪组织中成功分离出脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测CD44及CD90阳性,CD34及CD45阴性,多向分化能力。以MOI值1、10、25、50、75、100、150携带EGFP的慢病毒感染hADSCs时,其感染效率依次为0.24%、13.48%、40.33%、89.27%、94.52%、98.49%和99.11%。以MOI值50感染iADSCs,比较感染前后细胞的增殖与成脂能力,差异无统计学意义(P>0.05);2.流式细胞仪测定HUVEC表面分子CD31 (+), CD34马阳性;MTT结果显示HUVEC增殖速度快于1ADSCs,以 HUVEC:hADSCs为1：4比例共同培养3天后,细胞融合时两者比例约为1：1;将共培养细胞接种于丝素蛋白支架,成脂诱导14天后,通过RT-PCR可成功测定出PPARγ2基因的表达,油红O染色表明成脂诱导后,两组均能诱导出大量的脂肪细胞;3.饲养4w及8w后,大体标本结果显示均能修补软组织缺损,比较两组构建物的湿重：VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培养组> VEGF165-hADSCs组,冰冻切片后行油红O染色均可见红染的脂滴,电镜下共培养细胞状态明显优于较单纯hADSCs组;HE染色两组均有不同程度的血管化,但VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培养组血管数目明显多于单纯VEGF165-hADSCs组。[结论]：1.慢病毒感染ADSCs的最佳MOI值为50,感染后对hADSCs增殖,成脂能力无明显影响;2. hADSCs可与HUVEC共同培养,以1：4比例构成共培养组与丝素蛋白联合,可在丝素蛋白支架上成功构建出工程脂肪。3.以慢病毒介导VEGF165感染的hADSCs与HUVEC共培养体系为种子细胞,有孔丝素蛋白为支架材料,所构建的组织工程脂肪可有效修复大鼠软组织缺损。

关键词：脂肪组织工程人脂肪间充质干细胞人脐静脉内皮细胞丝素蛋白软组织缺损血管生成血管内皮细胞生长因子

白藜芦醇联合hADSCs抗衰老作用及相关MET机理研究

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白藜芦醇联合hADSCs抗衰老作用及相关MET机理研究

作者：刘淼成都医学院

学位级别：硕士

目的:白藜芦醇、脂肪间充质干细胞均有抗衰老作用,本文旨在将二者联合运用与单独作用的抗衰老效果作比较并探究其中机理。方法:采用酶消化-组织块培养法中分离培养人眼睑皮下脂肪间充质干细胞(Human dipose mesenchymal stem cells,hADS... 详细信息

目的:白藜芦醇、脂肪间充质干细胞均有抗衰老作用,本文旨在将二者联合运用与单独作用的抗衰老效果作比较并探究其中机理。方法:采用酶消化-组织块培养法中分离培养人眼睑皮下脂肪间充质干细胞(Human dipose mesenchymal stem cells,hADSCs)和人真皮成纤维细胞(Human Dermal Fibroblasts,HDFs),流式细胞术鉴定hADSCs干细胞表型并行成脂诱导,免疫组化鉴定HDFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原;建立HDFs自然衰老细胞模型,采用transwell共培养小室将白藜芦醇(RSV)、人脂肪间充质干细胞(hADSCs)和自然衰老人真皮成纤维细胞(HDFs)分组共培养,分为四个组:(1)hADSCs单独作用于衰老人真皮成纤维细胞组;(2)RSV单独作用于衰老人真皮成纤维细胞组;(3)hADSCs+RSV协同作用组;(4)对照组。采用蛋白印记的方法检测共培养后各组细胞的SIRT1和β-catenin蛋白表达情况。qRT-PCR法检测各组成纤维细胞的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-1、β-半乳糖苷酶的表达。结果:从人眼睑皮下脂肪处提取得来的细胞,培养后流式细胞术鉴定hADSCs干细胞表型:表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45,检测结果符合间充质干细胞的特异性表达。该细胞再加入成脂诱导液培养两周后可见成串脂滴形成。从眼睑真皮提取来的细胞培养后免疫组化染色表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原,鉴定结果符合成纤维细胞。在transwell小室环境下共培养后,蛋白印记的方法检测共培养后各组细胞的SIRT1和β-catenin蛋白表达情况为hADSCs+RSV协同作用组高于二者单独作用组,QRT-PCR法检测共培养后各组成纤维细胞的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达趋势为hADSCs+RSV协同作用组高于二者单独作用组。MMP-1、β-半乳糖苷酶的表达趋势为hADSCs+RSV协同作用组低于二者单独作用组。结论:原代培养源于真皮成纤维细胞在自然衰老后,白藜芦醇与脂肪间充质干细胞联合运用的抗衰老效果优于单独运用,且与间充质-上皮转化(MET)相关。

关键词：白藜芦醇人脂肪间充质干细胞人真皮成纤维细胞抗衰老间充质-上皮转化

hADSCs肝样分化、标记及Caveolin-1在分化中的作用

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hADSCs肝样分化、标记及Caveolin-1在分化中的作用

作者：王楠辽宁师范大学

学位级别：硕士

终末期肝病是由多种急慢性肝病导致的临床综合征。应用干细胞再生产生正常肝细胞代谢功能的“肝脏组织”,进行体外支持或体内植入,可以解决肝脏来源的疑难。脂肪间充质细胞(ADSCs)作为自体细胞移植的种子细胞在再生医学中发挥着重要作... 详细信息

终末期肝病是由多种急慢性肝病导致的临床综合征。应用干细胞再生产生正常肝细胞代谢功能的“肝脏组织”,进行体外支持或体内植入,可以解决肝脏来源的疑难。脂肪间充质细胞(ADSCs)作为自体细胞移植的种子细胞在再生医学中发挥着重要作用。由于能在体外培养稳定扩增,并在体内和体外分化成为肝细胞,ADSCs可以作为自体干细胞治疗肝脏疾病的种子细胞。 Caveolin-1(窖蛋白-1,Cav-1)是组成胞膜窖的主要功能蛋白。由于在脂滴和新生细胞膜的形成以及肝再生的能量供应中发挥着重要作用,因此是Cav-1肝再生所必需的蛋白。然而,Cav-1是否参与并影响ADSCs向肝细胞分化这一过程尚不明确。目的：本论文以人脂肪间充质干细胞为实验对象,利用生长因子联合诱导技术建立肝样细胞模型,通过检测干细胞向肝样细胞诱导过程中Cav-1蛋白的表达,初步探讨Cav-1在肝样细胞诱导分化过程中的作用及介导的相关信号途径,旨在了解干细胞向肝细胞诱导分化的机制。方法：1、分离、提取及培养人源脂肪间充质干细胞并鉴定其性质。2、通过HGF、bFGF、EGF和Dex联合诱导,免疫荧光及RT-PCR方法对诱导细胞进行鉴定。3、体外MR评估自合成SPIO作为干细胞移植的MR活体内示踪的安全性和有效性。4、Western Blot方法检测不同诱导时期肝样细胞中Cav-1、ER-a36及MAPK信号通路蛋白表达。结果：1、分离提取了hADSCs,通过性质的鉴定表明,提取的hADSCs较为原始,干性强,具有多项分化的能力。2、生长因子联合诱导建立了肝细胞样模型,发现随诱导时间的延长,干性基因Oct4、Nanog表达量逐渐减少;ALB、CYP1A1、HNF1A、HNFIB等基因表达量逐渐增多;AFP表达先增高再降低。说明干细胞向肝样细胞分化诱导成功。3、自合成SPIO对脂肪间充质干细胞标记,在25μg/mL浓度时细胞的增殖水平正常,且在MR检测上具有显著性差异。4、在]hADSCs肝样分化的过程中Cav-1蛋白和MAPK信号通路蛋白表达逐渐增高。Cav-1及ER-a36表达随诱导时间的延长显著增高,在诱导7day时MAPK信号通路被激活。结论：自脂肪组织内提取足够数量的脂肪间充质干细胞,并可在体外获得稳定、可持续的扩增,并具有多项分化的能力;MAPK信号通路介导了hADSCs向肝样细胞分化过程,且Cav-1在这一过程中起到关键性作用;自合成纳米磁性四氧化三铁可以作为脂肪间充质干细胞标记物。

关键词：人脂肪间充质干细胞肝细胞诱导分化纳米磁性四氧化铁 Caveolin-1

人ADSCs移植对大鼠急性重症胰腺炎的治疗作用及其机制

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山东医药 2019年第19期59卷 42-45,49页

作者：唐楠谭雪莹张德国黄飞史光军潍坊医学院山东潍坊261000 青岛大学附属青岛市市立医院大连医科大学

目的探讨人脂肪间充质干细胞(ADSCs)移植对大鼠急性重症胰腺炎(SAP)的治疗作用及其可能的作用机制。方法选择雄性SD大鼠45只,随机分为假手术组、模型组、移植组,每组15只。模型组、移植组按胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠法建立SAP模型,当观... 详细信息

目的探讨人脂肪间充质干细胞(ADSCs)移植对大鼠急性重症胰腺炎(SAP)的治疗作用及其可能的作用机制。方法选择雄性SD大鼠45只,随机分为假手术组、模型组、移植组,每组15只。模型组、移植组按胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠法建立SAP模型,当观察到胰腺充血、水肿时,移植组于胰腺被膜下注射人ADSCs,模型组不予处理。假手术组开腹后经胰胆管逆行注射台式液。移植6、12、24h,各组分别取5只,记录腹水量,采用ELISA法检测血清淀粉酶、TNF-α;取胰头组织,HE染色,观察胰腺组织形态学变化;分别采用RT-PCR法、Western blotting法检测胰头组织磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)mRNA与蛋白表达。结果随着移植时间延长,移植组和模型组腹水量较假手术组均逐渐增多(P均0.05);移植组和模型组各时间血清淀粉酶、TNF-α水平均明显高于对照组,但移植组血清淀粉酶、TNF-α水平较模型组同期均明显降低(P均细胞浸润情况均较模型组轻微。模型组p-AKT、p-NF-κBmRNA与蛋白相对表达量均明显高于假手术组,而移植组p-AKT、p-NF-κBmRNA与蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均人ADSCs移植对大鼠SAP具有一定治疗作用,其作用机制可能与抑制AKT磷酸化进而抑制NF-κB激活,继而产生弱化“二次打击”扳机点作用有关。

关键词：急性重症胰腺炎干细胞移植人脂肪间充质干细胞