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人肾小管上皮细胞及正常肝细胞在药物毒性器官选择中的应用

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中国临床药理学杂志 2015年第1期31卷 48-51,55页

作者：王磊刘艳菊葛鹏张金晓申秀萍天津药物研究院天津市新药安全评价研究中心天津300301

目的探讨人肾小管上皮细胞(HK-2)及人正常肝细胞(L-02)在药物毒性器官选择中的应用。方法以肾毒性药物庆大霉素、顺铂、环孢素A及肝毒性药物硫唑嘌呤作用于HK-2及L-02细胞24 h,考察并比较药物对2种细胞的形态、存活、凋亡及酶学指标变... 详细信息

目的探讨人肾小管上皮细胞(HK-2)及人正常肝细胞(L-02)在药物毒性器官选择中的应用。方法以肾毒性药物庆大霉素、顺铂、环孢素A及肝毒性药物硫唑嘌呤作用于HK-2及L-02细胞24 h,考察并比较药物对2种细胞的形态、存活、凋亡及酶学指标变化的影响。结果肾毒性药物在较低浓度下即可引起HK-2细胞的形态、存活、凋亡及酶学指标的显著性变化,肝毒性药物则在较低浓度下即可引起L-02细胞相关指标的显著性变化;比较4种药物的IC10值发现:3种肾毒性药物对HK-2的IC10值均小于对L-02的IC10值;而肝毒性药物硫唑嘌呤的IC10值则HK-2大于L-02。结论基于HK-2及L-02细胞评价药物的毒性器官选择性是可行性的。

关键词：人肾小管上皮细胞人正常肝细胞肾毒性肝毒性毒性器官选择性

面包皮中水溶性晚期糖基化终产物对人肾小管上皮细胞的氧化损伤

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食品科学 2018年第1期39卷 136-141页

作者：贾本盼袁晓金范智义胡静李巨秀西北农林科技大学食品科学与工程学院陕西杨凌712100

晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)是食品在热加工和贮藏过程中形成的一类化合物,与心血管疾病、糖尿病、肾病等多种慢性病的发生有重要联系。本实验研究了含有AGEs的面包皮水提取物(bread crust extract,BCE)对... 详细信息

晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)是食品在热加工和贮藏过程中形成的一类化合物,与心血管疾病、糖尿病、肾病等多种慢性病的发生有重要联系。本实验研究了含有AGEs的面包皮水提取物(bread crust extract,BCE)对人肾小管上皮细胞(human kidney tubular epithelial cells,HKCs)内氧化应激的影响及细胞损伤。采用不同质量浓度的BCE处理HKCs,并经噻唑蓝法确定后续BCE处理质量浓度;通过检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)及培养上清液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)水平,评价BCE对HKCs胞内氧化应激平衡及细胞损伤程度的影响。结果表明:不同质量浓度的BCE处理24 h后,HKCs胞内ROS水平随着BCE质量浓度的增大不断升高,且在8 mg/m L和12 mg/m L时胞内ROS水平达到最大值;与对照组相比,胞内MDA含量在BCE质量浓度为4 mg/m L和8 mg/m L时极显著增加(P细胞发生脂质过氧化反应,改变细胞膜通透性,使胞外LDH活力升高,导致细胞严重受损。

关键词：人肾小管上皮细胞面包皮水提取物氧化损伤脂质过氧化

人肾小管上皮细胞内SIGIRR对NF-κB活化的调控和NF-κB对SIGIRR的反馈调控以及SIGIRR调控EMT发生机制的初步研究

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人肾小管上皮细胞内SIGIRR对NF-κB活化的调控和NF-κB对SIGIRR的...

作者：蒋克国安徽医科大学

学位级别：硕士

背景和目的狼疮肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)最常见的并发症之一,且LN的严重程度对SLE患者死亡率及预期寿命有显著影响。目前为止LN的病因和发病机制尚未明确阐明。目前越来越多的研究报道Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)信... 详细信息

背景和目的狼疮肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)最常见的并发症之一,且LN的严重程度对SLE患者死亡率及预期寿命有显著影响。目前为止LN的病因和发病机制尚未明确阐明。目前越来越多的研究报道Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)信号通路参与SLE的发病机制。单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR),又称为Toll/interleukin-1受体8(TIR8),是TLR/IL-1R家族的成员,越来越多的证据表明SIGIRR对TLR/IL-1R信号通路具有负调控作用,并有可能成为SLE治疗的潜在靶点,但是何种机制调控SIGIRR的表达,目前还不清楚。核转录因子NF-κB(NF-κB)是一类功能广泛的核转录调控元件,被激活后可以调控多种基因的转录和翻译。在LN等免疫介导的肾脏疾病中TLR/IL-1R-NF-κB过度活化,参与调控炎性介质及细胞因子的产生。临床上很多药物的作用机制也是干预NF-κB的活化而控制疾病的发展。因此我们将在人肾小管上皮细胞内探讨SIGIRR可以调控NF-κB(p65)的过度活化和活化的NF-κB(p65)是否反过来又可以调控SIGIRR的表达,控制自我的过度活化使免疫保持平衡。另外在LN等慢性肾脏疾病进展至终末肾功能衰竭的进程中肾间质纤维化(RIF)发挥着重要作用,其中肾小管上皮-间充质细胞转分化(EMT),也称为肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转化,是RIF发生的关键事件。研究发现LN患者肾脏组织中过度表达活化的白介素lβ(IL-1β)可以通过TLR/IL-1R信号通路诱导肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞,在RIF的形成中发挥重要作用,而SIGIRR对该信号通路具有负调控作用,因此我们将探讨是否SIGIRR可以经TLR/IL-1R-NF-κB信号通路阻断IL-1β诱导的信号活化而改善人肾小管上皮细胞的转分化的发生。方法第一部分:针对SIGIRR基因的有效靶点设计sh RNA序列,与GV248-GFP-Puro慢病毒载体连接产生重组体(GV248-GFP-Puro-sh SIGIRR)。将测序验证正确的重组体与包装质粒(p MDL、p Rev和p VSVG)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒并感染HKC细胞。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和western blot法分析检测HKC细胞中SIGIRR干涉效率。应用IL-1β刺激成功敲低SIGIRR的HKC细胞及对照细胞,western blot检测其下游核转录因子NF-κB(p65)的磷酸化水平,荧光定量PCR分析单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和正常T细胞表达和分泌的活化调节蛋白(RANTES)m RNA水平。第二部分:该部分研究以野生型HKC为模型,构建p65稳定下调的HKC细胞系(HKC/shp65),经逆转录PCR(RT-PCR)、western blot和免疫荧光法检测SIGIRR表达情况。在线预测SIGIRR启动子区域NF-κB(p65)的结合位点,以野生型HKC细胞为模版,染色质免疫沉淀技术(Ch IP)初步验证NF-κB(p65)可以结合至SIGIRR启动子区域。提取人全基因组DNA,PCR方法调取SIGIRR启动子序列连接至p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。酶切和测序验证成功构建,之后把NF-κB(p65)与SIGIRR启动子DNA结合的序列进行定点突变构建突变载体并测序验证,再经荧光素酶报告基因实验间接的进一步验证NF-κB(p65)可结合调控SIGIRR的表达。第三部分:将人SIGIRR c DNA片段连接至逆转录病毒载体p LNCX2-G418,经PT67细胞包装成病毒感染HKC细胞,q RT-PCR和western blot证实SIGIRR过表达HKC细胞(HKC/SIGIRR)成功构建。HKC/SIGIRR细胞及对照细胞经IL-1β诱导后,倒置显微镜下观察细胞形态,western blot和免疫荧光检测EMT相关的分子标记(E-cadherin和Vimentin)变化,划痕实验和Transwell assay检测细胞迁移能力。提取核蛋白后western blot检测NF-κB(p-p65)表达,q RT-PCR法检测转化生长因子-β(transforming growthfactor-β,TGF-β)m RNA表达。结果第一部分:成功构建重组慢病毒载体GV248-GFP-Puro-sh SIGIRR。q RT-PCR和western blot均证实在HKC细胞中成功敲低SIGIRR的表达。此外,IL-1β刺激后,与对照细胞相比,敲低SIGIRR的HKC细胞(HKC/sh SIGIRR)的p65磷酸化水平上调,MCP-1和RANTES m RNA表达水平升高。第二部分:成功构建p6

关键词：狼疮性肾炎人肾小管上皮细胞 SIGIRR NF-κB TLR/IL-1R RIF EMT

草酸钙晶体诱导人肾小管上皮细胞铁死亡的机制

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中华泌尿外科杂志 2023年第8期44卷 622-629页

作者：周凯赵嘉闻黎承杨金华市人民医院肾内科金华321000 广西医科大学第一附属医院泌尿外科南宁530021

目的探讨草酸钙(CaOx)晶体诱导人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生铁死亡的机制。方法2021年3—9月使用CaOx晶体悬浊液干预HK-2细胞,构建HK-2-CaOx反应模型。设置CaOx晶体浓度分别为0、0.***.0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L,干预HK-2细胞24h... 详细信息

目的探讨草酸钙(CaOx)晶体诱导人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生铁死亡的机制。方法2021年3—9月使用CaOx晶体悬浊液干预HK-2细胞,构建HK-2-CaOx反应模型。设置CaOx晶体浓度分别为0、0.***.0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L,干预HK-2细胞24h,干预完成后提取HK-2细胞蛋白。采用最佳干预浓度的CaOx晶体干预HK-2细胞,分别于干预后0、3、6、9、12、24、48h提取细胞蛋白。蛋白质印迹法检测细胞内铁死亡标志蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。用铁死亡诱导剂爱拉斯汀(Erastin)和铁死亡抑制剂3-氨基4-环已基氨基苯甲酸乙酯(Fer-1)干预HK-2细胞以调控细胞内铁死亡水平。将HK-2细胞分为4组:正常对照组(NC组),无干预处理,单纯使用完全培养基培养;CaOx晶体刺激组(CaOx组),使用含4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养;CaOx晶体+Erastin处理组(CaOx+Erastin组),使用含10.0μmol/LErastin和4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养;CaOx晶体+Fer-1处理组(CaOx+Fer-1组),使用含1.0μmol/LFer-1和4.0mmol/LCaOx晶体的完全培养基培养。培养24h后,采用蛋白质印迹法和免疫荧光技术检测GPX4、长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)在HK-2细胞内的表达情况;检测HK-2细胞内谷胱甘肽含量;采用DCFH-DA荧光染色法观察HK-2细胞活性氧(ROS)表达情况。通过光学显微镜观察各组HK-2细胞内CaOx黏附情况,DAPI染色检测HK-2细胞核损伤情况。结果采用0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.08.0mmol/L浓度CaOx晶体干预24h后,细胞中CPX4的表达量分别为5.67±1.05、5.60±0.02、4.99±0.94、4.82±0.93、4.50±0.70、4.14±0.53、0.97±0.53,4.0mmol/L组与0mmol/L组相比差异有统计学意义(P=0.026)。选用4.0mmol/L作为最佳浓度干预细胞,干预0、3、6、9、12、24、48h后细胞中CPX4的表达量分别为11.73±1.29、11.68±1.32、11.72±1.30、10.97±1.28、10.63±1.21、8.79±1.10、8.03±1.06,24 h组与Oh组相比差异有统计学意义(P=0.090)。CaOx+Erastin组与NC组相比,ACSL4表达量(9.71±0.68与3.96±0.17,P细胞核损伤比例分别为2.85%、11.96%、8.76%、16.27%。结论CaOx晶体可以通过增加HK-2细胞内氧化应激水平进而诱导HK-2细胞发生铁死亡.

关键词：活性氧铁铁死亡细胞损伤草酸钙晶体人肾小管上皮细胞

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

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上海交通大学学报（医学版） 2009年第5期29卷 513-516页

作者：陈永熙李娅张文陈晓农王伟铭张群业黄秋花陈楠上海交通大学医学院瑞金医院肾脏科上海200025 上海交通大学医学院瑞金医院上海血液学研究所医学基因组学国家重点实验室上海200025

目的建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础。方法将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴... 详细信息

目的建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础。方法将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学。结果通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段。随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5%～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05)。结论iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础。

关键词：相对和绝对定量的同位素标签试剂定量蛋白质组学人肾小管上皮细胞

紫檀芪减轻人肾小管上皮细胞高糖缺氧复氧损伤及其作用机制的研究

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中国糖尿病杂志 2020年第3期28卷 216-221页

作者：陈柳杨坤郭昆全锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地十堰442000 湖北医药学院附属国药东风总医院内分泌科

目的探究紫檀芪(PTE)对人肾小管上皮细胞(HK-2)高糖缺氧复氧损伤的保护作用及其可能的作用机制.方法随机将HK-2细胞分为低糖缺氧复氧组(LR)、高糖缺氧复氧组(HR)、高糖缺氧复氧+PTE 组(HR+P)、高糖缺氧复氧组+PTE+沉默信息调节因子 1(... 详细信息

目的探究紫檀芪(PTE)对人肾小管上皮细胞(HK-2)高糖缺氧复氧损伤的保护作用及其可能的作用机制.方法随机将HK-2细胞分为低糖缺氧复氧组(LR)、高糖缺氧复氧组(HR)、高糖缺氧复氧+PTE 组(HR+P)、高糖缺氧复氧组+PTE+沉默信息调节因子 1(SIRT1)抑制剂组(HR+P+EX).缺氧复氧结束后采用CCK-8试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞活性,超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)试剂盒检测SOD活性及MDA含量;活性氧簇(ROS)染色检测细胞内ROS含量;Western blot检测HK-2细胞SIRT1、Beclin1、泛素结合蛋白(SQSTM1/p62)和微管相关蛋白轻链3B(LC3B)的表达.结果与LR组比较,HR组LDH、MDA及ROS染色荧光强度增加,CCK-8及SOD降低,SQSTM1/p62表达上调(P细胞SIRT1表达,促进自噬的恢复,减轻高糖缺氧复氧引起的损伤.

关键词：紫檀芪人肾小管上皮细胞高糖缺氧复氧损伤自噬

胰岛素对人肾小管上皮细胞SREBP-1、FAS表达及脂质代谢的时效性研究

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中国药理学通报 2010年第4期26卷 517-521页

作者：郝军刘淑霞刘青娟赵松郑书深姚芳刘巍段惠军河北医科大学病理学教研室河北石家庄050017

目的探讨胰岛素对人肾小管上皮细胞(human renal proximal tubularepithelial cells line,HKCcells)固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)和脂肪酸合成酶(fat acid synthase,FAS)表达以及细胞内脂滴形成的时效性影响。方法给予人肾小管上皮细胞100nmol·L-1胰岛素刺激并根据刺激时间分为0、2、4、6、12和24h组。SREBP-1和FAS mRNA采用RT-PCR检测,SREBP-1蛋白的表达用免疫细胞化学和Western blot检测,细胞内脂滴检测采用油红O染色。结果和0h组相比,2h组HKC细胞未见SREBP-1和FAS mRNA表达变化,而4、6、12h组HKC细胞SREBP-1和FAS mRNA表达均升高,其中6h组升高最明显,分别是0h对照组的3.578倍和4.272倍,差异有统计学意义。Western blot检测显示4、6和12h组HKC细胞SREBP-1蛋白的前体和成熟片段表达均较0h和2h组增强,其中也是6h组表达最强,前体和成熟片段分别是0h组的4.106倍和5.167倍。免疫细胞化学技术显示SREBP-1蛋白在人肾小管上皮细胞株中定位于细胞质,在4、6和12h组HKC内其表达明显强于0、2和24h组。油红O染色提示胰岛素刺激6h后HKC细胞内可见明显红染脂滴颗粒,而其他各组HKC细胞未见着色。结论胰岛素呈时间依赖性引起人肾小管上皮细胞SREBP-1和FAS的上调,且作用在6h达到高峰,并最终导致细胞内脂滴沉积,这可能是代谢综合征引起肾脏脂质沉积的重要机制之一。

关键词：胰岛素人肾小管上皮细胞固醇调节元件结合蛋白-1 脂肪酸合成酶脂滴形成时效性影响

高糖激活PI3K/AKT/mTORC1通路诱导人肾小管上皮细胞骨桥蛋白的表达

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中国药理学通报 2014年第8期30卷 1156-1160页

作者：王凤梅蒋克国张桂霞周海胜查晓军郝丽王德光安徽医科大学第二附属医院肾内科安徽合肥230601 安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室安徽合肥230032 皮肤病学国家重点实验室培育基地安徽合肥230032

目的探讨高糖刺激上调人肾小管上皮细胞株(HK-2)骨桥蛋白(OPN)表达的分子机制。方法利用高糖(25mmol·L-1)刺激HK-2细胞,并应用特异性抑制剂、siRNA抑制PI3K和(或)mTOR活性,应用Real-time PCR检测OPN mRNA表达;Western blot检测OPN、p-... 详细信息

目的探讨高糖刺激上调人肾小管上皮细胞株(HK-2)骨桥蛋白(OPN)表达的分子机制。方法利用高糖(25mmol·L-1)刺激HK-2细胞,并应用特异性抑制剂、siRNA抑制PI3K和(或)mTOR活性,应用Real-time PCR检测OPN mRNA表达;Western blot检测OPN、p-AKT、p-S6、Raptor和Rictor蛋白表达。结果高糖刺激呈时间依赖性上调HK-2细胞OPN表达,其中,OPN mRNA在刺激48h后达高峰;OPN蛋白表达在72h达到最高。此外,高糖刺激激活PI3K/AKT/mTORC1信号通路。利用PI3K特异性抑制剂LY294002、mTORC1特异性抑制剂rapamycin抑制PI3K/AKT/mTOR通路后,HK-2细胞的OPN表达明显降低。进一步,siRNA敲低Raptor降低HK-2细胞中OPN蛋白的表达,而敲低Rictor对OPN蛋白表达无影响。结论高糖通过激活PI3K/AKT/mTORC1通路上调HK-2细胞OPN的表达。

关键词：高糖人肾小管上皮细胞骨桥蛋白雷帕霉素调控机制

氯化镉对人肾小管上皮细胞线粒体功能及PGC-1α蛋白表达的影响

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卫生研究 2018年第2期47卷 290-295页

作者：袁琳韩光亮新乡医学院公共卫生学院新乡453003

目的探讨氯化镉(CdCl_2)对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)线粒体功能、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子α(PGC-1α)蛋白表达的影响,以及CdCl_2致HK-2细胞线粒体氧化损伤的机制。方法体外培养HK-2细胞,以0、10、20、30、40、50和6... 详细信息

目的探讨氯化镉(CdCl_2)对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)线粒体功能、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子α(PGC-1α)蛋白表达的影响,以及CdCl_2致HK-2细胞线粒体氧化损伤的机制。方法体外培养HK-2细胞,以0、10、20、30、40、50和60μmol/L CdCl_2干预24 h后收集细胞,MTT法观察细胞活力;Mito SOXTM活细胞荧光染色观察线粒体中活性氧(ROS)生成情况,多功能酶标仪测定线粒体中呼吸链复合物Ⅲ活性,流式细胞仪分析线粒体膜电位变化;Western blot法检测CdCl_2对HK-2细胞总蛋白中PGC-1α表达的影响。结果与对照组相比,当CdCl_2浓度增加到20、60μmol/L作用24 h后HK-2细胞存活率下降为(77.60±0.82)%和(41.97±1.22)%(P细胞总蛋白中PGC-1α蛋白的表达随氯化镉剂量的增加而减少(P细胞的毒性损伤。

关键词：氯化镉人肾小管上皮细胞线粒体氧化损伤