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中国司法鉴定 2022年第1期 85-92页

作者：董婷婷肖作润刘增甲王业全张国安崔文济宁医学院法医学与医学检验学院山东济宁272067

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一... 详细信息

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h内的个体,分别于尸检即刻(12 h以内)、3、5、7、10 d各取50 g组织进行总RNA提取,并进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,初步得到circRNA表达谱;对筛选出的circRNAs在后续收集的18例检材中进行验证,对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,但在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019717个。对所筛选出的7个circRNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_00002845个circRNAs随着死亡时间增加,其相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。而hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019712个circRNAs的表达为阴性。结论circRNA是一种较为稳定的生物标记物,部分可用于死亡时间推断的研究。

关键词：法医病理学死亡时间推断人肋间肌基因芯片环状RNA

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骨骼肌circRNA在法医学死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

骨骼肌circRNA在法医学死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

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作者：董婷婷青岛大学

学位级别：硕士

目的死亡时间(postmortem interval,PMI)的精确推断一直是法医学中的重点和难点,但是到目前为止还没有得到统一的检测方法和指标。本研究通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circ RNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序... 详细信息

目的死亡时间(postmortem interval,PMI)的精确推断一直是法医学中的重点和难点,但是到目前为止还没有得到统一的检测方法和指标。本研究通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circ RNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circ RNAs,并进一步对筛选出的circ RNAs进行验证,然后探讨其相对表达量与死亡时间的相关性,为法医学中对死亡时间推断提供一个新的思路及指标。方法(1)芯片实验:(1)选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h以内的个体,取其右侧第三、四肋间肌组织,放置在PBS缓冲液中于温度为18℃,湿度为50%的人工气候箱中模拟自然降解过程;(2)分别于尸检即刻(0天)、3天、5天、7天、10天各取50 g组织放入液氮中冻存,然后进行总RNA的提取;(3)对提取的RNA进行质检,质检合格后,进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,最终得到circ RNA表达谱。(2)circ RNAs的筛选及验证:(1)将后续收集到的与之前外界温度、湿度相对一致的18例死亡个体的肋间肌检材放置在相同条件的人工气候箱中;(2)分别于死亡1-10天定时取适量组织进行RNA提取、逆转录,然后将所得c DNA放置在-80℃冰箱,以便后续实验的进行;(3)根据Norm Finder软件筛选GAPDH、β-Actin、mir133a-3p三者中最稳定的内参基因;(4)根据所得的circ RNA表达谱筛选与死亡0天具有显著差异的circ RNA,并去除分子量过大或过小以及表达量较低的circ RNAs;(5)对筛选出的circ RNAs在文献中查找其已经验证过的引物序列,如有相同circ RNA,则直接利用其序列;若未找到相关文献报道,则利用circbase查找其基因序列,并用primer-blast进行引物设计;(6)用上述所得c DNA对所筛选出的circ RNAs进行Q-PCR实验,在18例检材中验证它们的相对表达量与死亡时间的相关性。(3)统计分析:利用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,通过与死亡0天的circRNAs的相对表达量相比,具有明显下降趋势的circ RNAs在第三天共有353个,第5天共有259个,第7天共有273个,第10天共有290个,且均为P2。但在10天内整体呈下降趋势的circ RNAs只有hsairc000284、hsairc001136、hsairc001727、hsairc005251、hsairc001871、hsairc001946、hsairc001971等7个。根据Norm Finder软件对内参基因的筛选,发现mir133a-3p在本实验中最稳定。对所筛选出的7个circ RNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsairc000284、hsairc001136、hsairc001727、hsairc005251、hsairc001871等5个circ RNAs随着死亡时间的增加,其相对表达量显著下降,且具有统计学意义(P肌肉组织可作为测定中晚期死亡时间的候选组织(2)mir133a-3p在本实验中为最稳定的内参基因。(3)经验证发现hsairc000284、hsairc001136、hsairc001727、hsairc005251、hsairc001871等5个基因随着死亡时间增加,其相对表达量显著降低。(4)circ RNA可作为一种较为稳定的生物标记物用于死亡时间推断的研究。

关键词：法医病理学死亡时间推断人肋间肌基因芯片环状RNA

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