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人白细胞介素12双亚基共表达载体的构建及表达

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中国免疫学杂志 2004年第2期20卷 79-82页

作者：羊东晔卢放根汤熙翔赵水平吴小平刘小伟湖南长沙中南大学湘雅二医院消化内科和心血管内科长沙410011

目的 :为了基因治疗研究的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基基因共表达质粒 [(P(+) IL 12 ) ],比较它与单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]1∶1共同转染肝癌细胞HepG2后 4 8小时表达结果。方法 :分别克隆hIL 12P4... 详细信息

目的 :为了基因治疗研究的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基基因共表达质粒 [(P(+) IL 12 ) ],比较它与单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]1∶1共同转染肝癌细胞HepG2后 4 8小时表达结果。方法 :分别克隆hIL 12P4 0 、P35亚基cDNA全长至pcDNA3 1(± )中构建P(+) P4 0 和P(- ) P35,再将两者串联克隆至pcDNA3 1(+)中构建P(+) IL 12。脂质体转染 3种质粒至肝癌细胞HepG2 ,4 8小时后抽取细胞总RNA做半定量RT PCR ,同时取细胞上清做ELISA及Western杂交 ,结果进行比较分析。结果 :两种转染方式均可以表达hIL 12蛋白质且半定量RT PCR显示较未转染组hIL 12的mRNA水平均增加 ;转染后 4 8小时P(+) IL 12组细胞培养上清hIL 12表达量较 [P(+) P4 0 和P(- ) P35]按 1∶1比例共同转染组显著增高(P 人白细胞介素 12双亚基基因串联共表达质粒 [P(+) IL 12 ]能够转入HepG2并表达hIL 12蛋白质 ,并且转染后 4 8小时hIL 12表达量较单个亚基基因表达质粒 [P(+) P4 0 、P(- ) P35]1∶1共转染者显著高。

关键词：人白细胞介素12 真核表达载体pcDNA3.1(±) HepG2细胞表达

人白细胞介素12双亚基共表达真核载体的构建

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湖南医科大学学报 2003年第4期28卷 338-342页

作者：羊东晔卢放根赵水平汤熙翔刘小伟吴小平中南大学湘雅二医院消化内科长沙410011 中南大学湘雅二医院心内科长沙410011 生生基因药物研究所长沙410008

目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(... 详细信息

目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(+) /P4 0 和P( ) /P3 5,然后再将二者串联克隆入真核表达载体 pcDNA3.1(+)中得到P(+) /IL 12质粒。脂质体转染HepG2后 2 4,48hELISA检测细胞培养上清内hIL 12蛋白质表达。结果 :P(+) /IL 12质粒经酶切和测序证明两亚基连接方向正确 ,序列无突变 ;ELISA检测细胞上清结果证实可表达hIL 12蛋白质。结论 :成功构建P4 0 和P3 5双亚基真核共表达质粒———P(+) /IL 12 ,为模拟hIL 12生理表达方式 ,简化hIL 12基因治疗操作奠定了基础。

关键词：人白细胞介素12 双亚基表达真核载体克隆

应用重组PCR技术构建人单链白细胞介素12融合基因

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免疫学杂志 2001年第1期17卷 22-26页

作者：张梅司履生王一理西安交通大学第一医院血液病研究室陕西西安710061 西安交通大学基础医学院免疫病理学研究室陕西西安710061

目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (G... 详细信息

目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3碱基序列进行前后拼接 (IL- 12 p40 -多肽接头 - p35 ) ,构建 hsc IL- 12融合基因 ,并进行核苷酸序列测定 ,进一步将 hsc IL - 12融合基因插入 pc DNA3.1真核表达载体中 ,转染 COS- 7细胞表达 hsc IL - 12融合蛋白 ,并行 Western blot分析。结果该融合基因经 DNA序列分析表明 :p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确 ,融合基因可在 COS- 7细胞中表达hsc IL- 12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子量为 70 0 0 0 u,可与鼠抗人 IL- 12 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论重组 PCR技术是十分有效。

关键词：重组PCR 人白细胞介素12 人单链白细胞介素融合基因

自然杀伤实验检测人白细胞介素12的生物学活性

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海军医学杂志 2001年第4期22卷 301-303页

作者：龙建秋高军李茂曹敏海军医学研究所上海200433

目的 :评价前期已构建的含有重组人白细胞介素 12基因的真核载体的表达能力。方法 :重组IL 12真核表达载体体外转染 2 93细胞后 ,收集 72h培养上清 ,用LDH法检测上清对自然杀伤活性的增强作用 ,并用标准品进行对比分析。结果 :实验前期... 详细信息

目的 :评价前期已构建的含有重组人白细胞介素 12基因的真核载体的表达能力。方法 :重组IL 12真核表达载体体外转染 2 93细胞后 ,收集 72h培养上清 ,用LDH法检测上清对自然杀伤活性的增强作用 ,并用标准品进行对比分析。结果 :实验前期所构建的表达载体可真核表达IL 12蛋白 ,其含量在 2 .5～ 5 .0ng/ml之间。结论 :可直接测得IL 12的生物活性 ,并能由此对所构建的载体的表达能力进行分析。

关键词：人白细胞介素12 乳酸脱氢酶自然杀伤实验

农杆菌介导的hIL-12基因转化马铃薯的研究

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华北农学报 2008年第3期23卷 46-49页

作者：邵敏周鹤峰葛正龙遵义医学院珠海校医生物化学教研室广东珠海519041 遵义医学院珠海校区生物工程教研室广东珠海519041 遵义医学院生物化学教研室贵州遵义563003

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR... 详细信息

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR阳性植株中随机选取5株,ELISA法检测茎和叶中hIL-12的表达量,其中2株与对照组相比有显著性差异(p12的表达量分别为(3 714.0±48.8)pg/g和(3 465.0±185.0)pg/g,初步表明外源基因hIL-12已经整合进马铃薯基因组中并得到了表达,为进一步研究重组hIL-12的分离纯化和生物学活性奠定了试验基础。

关键词：马铃薯人白细胞介素12 遗传转化根癌农杆菌

hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定

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hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的...

作者：张鹏中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

目的为在肿瘤基因治疗领域展开更深入的研究,探索新的肿瘤基因治疗策略,我们构建了由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT启动子)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和人白细胞介素12(hIL-12)融合基因表达载体,并鉴定其在细胞中的表达,为其... 详细信息

目的为在肿瘤基因治疗领域展开更深入的研究,探索新的肿瘤基因治疗策略,我们构建了由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT启动子)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和人白细胞介素12(hIL-12)融合基因表达载体,并鉴定其在细胞中的表达,为其进一步研究奠定了实验基础。方法分别以人Hela细胞基因组、pNZTK2. pCMV6-XL4p40和人脾文库为模板,利用PCR法分别扩增hTERT启动子序列、HSV-TK序列、人IL-12p40和IL-12p35序列。将人IL-12p40和IL-12p35基因利用重组PCR法融合成人IL-12p70基因。之后,再次利用重叠扩增法对IL-12p70的单一位点进行突变。并将合成的hTERT启动子基因、HSV-TK基因、人IL-12p70点突变基因分别克隆至pShuttle载体上,合成pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体。酶切和测序检验结果表明载体正确无误。使用VigoFect试剂盒将合成载体转染293T细胞,利用western-blot法和细胞间接免疫荧光法检测其在细胞中的表达。结果各基因片段成功扩增,大小分别为1084bp、1173bp和1557bp,与预期大小相符合,并成功联结至pShuttle载体上。对所构建新载体分别行酶切鉴定,结果显示各融合基因片段酶切大小与预期大小相符。同时,DNA序列测定结果显示,IL-12p70点突变构建成功,其他碱基与目标序列完全一致,无突变发生。将构建成功的pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12载体转染293T细胞后,使用western-blot法和间接免疫荧光法分别进行表达鉴定,只有转染pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体的细胞裂解物中能够检测到融合基因的表达且能明显观察到FITC的绿色荧光,而转染空载体的细胞中则未检测到,证明构建载体在细胞水平有所表达。结论成功构建了肿瘤特异性启动子调控的融合基因表达载体pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12,并成功地在细胞中表达。为进一步应用肿瘤特异性启动子调控的融合基因载体治疗肿瘤奠定了坚实基础。

关键词：人端粒酶逆转录酶启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶基因人白细胞介素12 融合基因表达载体

靶向基因药物分子构形和大小与表达量关系的体外研究——人白细胞介素12靶向治疗肝癌的临床前研究

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胃肠病学 2002年第B11期7卷 29-29页

作者：羊东晔吴晓英等中南大学湘雅二院消化内科410011 中南大学电镜室

人白介素12亚基p40和p35基因串联在毕赤酵母中的表达及表达产物活性分析

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中国生物工程杂志 2008年第3期28卷 20-24页

作者：周鹤峰邵敏孙伟刘银花李官成葛正龙遵义医学院珠海校区生物工程教研室珠海519041 遵义医学院珠海校区生物化学教研室珠海519041 遵义医学院生物化学教研室遵义563003

利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12(hscIL-12),PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导... 详细信息

利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12(hscIL-12),PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导,hscIL-12在酵母中获得分泌表达,表达产物经Western blot检测,显示该蛋白相对分子质量为70kDa,可与鼠抗人IL-12单克隆抗体特异性结合;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中hscIL-12约占总蛋白的26%,表达量约为60mg/L;生物学活性实验表明,重组蛋白能促进人外周血淋巴细胞增殖。为利用rhscIL-12进行基因治疗奠定了基础。

关键词：人白细胞介素12 毕赤酵母分泌表达活性分析

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

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生物技术通讯 2012年第3期23卷 383-385页

作者：赵善民赵勇张彩勤毛峰峰白冰张海师长宏徐志凯第四军医大学实验动物中心西安710032 第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免... 详细信息

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。

关键词：耻垢分枝杆菌肝素结合血凝素人白细胞介素12 保护力