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人牙髓干细胞低氧培养的研究进展

口腔生物医学 2017年第4期8卷 219-222页

作者：任璇张志民李玉娇吉林大学口腔医院牙体牙髓病科吉林长春130021

细胞的缺氧应答反应是由多因子多通路调控的。研究表明,低氧条件下培养人牙髓干细胞可提高其增殖和分化潜能,促进血管及骨的再生,对细胞的凋亡和旁分泌作用也有显著影响。提示低氧环境下人牙髓干细胞相关生物学特性的改变对牙髓组织的... 详细信息

细胞的缺氧应答反应是由多因子多通路调控的。研究表明,低氧条件下培养人牙髓干细胞可提高其增殖和分化潜能,促进血管及骨的再生,对细胞的凋亡和旁分泌作用也有显著影响。提示低氧环境下人牙髓干细胞相关生物学特性的改变对牙髓组织的修复与再生有着重要意义,并有望为牙髓损伤提供潜在治疗手段,促进组织工程和细胞疗法的进一步发展。

关键词：人牙髓干细胞低氧低氧诱导因子线粒体

人牙髓干细胞与β-TCP复合后的体内外实验研究

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人牙髓干细胞与β-TCP复合后的体内外实验研究

纤维内硅化胶原促人牙髓干细胞成骨分化的研究

全国第八次牙体牙髓病学学术会议

作者：李昊妍梁景平张秀丽殷德民上海交通大学医学院附属第九人民医院牙体牙髓科上海市口腔医学重点实验室上海市口腔医学研究所

目的:观察人牙髓干细胞与β-TCP复合培养后生物学特性变化及形成新生组织的情况。方法:将人牙髓干细胞与β-TCP混合体外培养3天、7天、14天后用扫描电镜观察细胞生长及分泌细胞外基质情况。据此将人牙髓干细胞与β-TCP在体外培养3天后... 详细信息

目的:观察人牙髓干细胞与β-TCP复合培养后生物学特性变化及形成新生组织的情况。方法:将人牙髓干细胞与β-TCP混合体外培养3天、7天、14天后用扫描电镜观察细胞生长及分泌细胞外基质情况。据此将人牙髓干细胞与β-TCP在体外培养3天后植入裸鼠体内,在4周和12周时取材,进行HE、Manory染色及免疫组化染色。结果:人牙髓干细胞与β-TCP体外培养后细胞生长良好,基质分泌旺盛。裸鼠体内培养12周后可见血管和新生组织,DSP和Ⅰ型胶原染色阳性。结论:人牙髓干细胞与β-TCP复合后生长状况良好

关键词：人牙髓干细胞 β-TCP DSP

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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纤维内硅化胶原促人牙髓干细胞成骨分化的研究

作者：孙佳琦第四军医大学

学位级别：硕士

肿瘤、骨质疏松、创伤、骨关节炎等多种原因导致的骨缺损一直严重影响着人们的健康和生活质量。尽管自体骨移植被认为是骨缺损的最佳修复方法，但是仍存在供体有限、手术创伤、并发症较多、手术时间长等问题。而同种异体骨移植和异种骨... 详细信息

肿瘤、骨质疏松、创伤、骨关节炎等多种原因导致的骨缺损一直严重影响着人们的健康和生活质量。尽管自体骨移植被认为是骨缺损的最佳修复方法，但是仍存在供体有限、手术创伤、并发症较多、手术时间长等问题。而同种异体骨移植和异种骨移植，则由于免疫排斥、生物相容性较差等缺点，在临床应用中受到了很大的限制。因此寻找理想的骨替代材料，成为了骨缺损修复面临的重要难题。随着研究的不断进展，近年来基于干细胞的骨组织工程已在骨缺损修复材料的研制方面取得一系列重要的进展。为了实现功能化骨的再生，组织工程三大关键要素即种子细胞、支架材料和生物活性因子的选择和整合至关重要。虽然骨髓间充质干细胞具有良好的成骨分化潜能，并已经在骨组织的重建再生方面得到了广泛的研究，然而细胞获取困难、费用高昂、创伤较大等问题限制了其在临床中的应用。与骨髓间充质干细胞相比，牙髓干细胞的获取方法容易，获取过程对患者造成的创伤和经济负担小，具有更高的克隆形成能力，并且已有研究表明牙髓干细胞能够分化为成骨细胞并形成骨组织，因此牙髓干细胞有望替代骨髓间充质干细胞，成为骨组织工程中理想的自体种子细胞。除种子细胞以外，支架材料是骨组织工程的又一重要因素，常见的支架材料有金属、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物等，然而现有的材料仍无法满足理想组织工程支架材料的要求。I型胶原为骨细胞外基质的主要有机成分，具有良好的生物相容性，是骨组织工程中常用的支架材料，但是易降解和机械性能较差等问题成为其应用的掣肘。为了解决这一问题，本课题组在前期研究中在国际上首次实现了重组I型胶原支架的纤维内硅化，显著提高了胶原支架的机械性能和耐酶解性，并且证实该支架材料能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，显示了其在骨缺损修复领域的应用前景。然而纤维内硅化胶原是否能促进牙髓干细胞的成骨分化，其分化特征如何，目前仍不清楚。因此本研究的目的是探索纤维内硅化胶原对牙髓干细胞成骨分化的影响，从而为纤维内硅化胶原和牙髓干细胞在骨组织工程中的应用提供实验基础。主要实验内容及结果 1.纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞活性的影响从人牙髓中分离牙髓干细胞，通过细胞形态、克隆形成能力、干细胞表面标志物等方面对细胞干性进行鉴定;通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察细胞生长情况和Propidium iodide检测细胞凋亡坏死情况，评估纤维内硅化胶原对细胞粘附、伸展及细胞凋亡坏死特性的影响;通过细胞周期实验和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）含量测定实验，检测纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞增殖特性的影响。结果表明所分离培养的人牙髓干细胞为成纤维样细胞，克隆形成率为25%，间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105的表达为阳性，造血干细胞的表面标志物CD34和CD45的表达为阴性;纤维内硅化胶原组、未硅化胶原组和空白对照组中正常人牙髓干细胞所占百分比无统计学差异（p＞0.05）;纤维内硅化胶原组中人牙髓干细胞的DNA含量和S期细胞百分比均明显高于未硅化胶原组和空白对照组（p＜0.05）。 2.纤维内硅化胶原促进人牙髓干细胞成骨分化的体外实验研究通过实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、蛋白免疫印迹、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、ALP活性检测、茜素红染色和冯库萨染色，从多个角度评估纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞成骨分化的影响。结果表明，与未硅化胶原组和阴性对照组相比，纤维内硅化胶原组中的成骨标志基因和蛋白成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor2，RUNX2）、成骨相关转录因子（osterix，OSX）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、ALP和I型胶原（type I collagen，COLI）的表达水平均明显增高（p＜0.05）;纤维内硅化胶原组中人牙髓干细胞内ALP活性及矿化沉淀形成量明显高于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）。 3.纤维内硅化胶原促进人牙髓干细胞成骨分化的体内实验研究分别构建人牙髓干细胞与纤维内硅化胶原及未硅化胶原的复合体，将各组细胞-支架复合体植入裸鼠皮下，8周后，进行伊红和苏木精（hemotoxylin and eosin，HE）染色、茜素红染色、冯库萨染色和免疫组织化学染色，观察骨样组织的形成情况。结果表明，纤维内硅化胶原组中骨细胞、血管和骨样组织的形成均明显多于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）;纤维内硅化胶原组中矿化沉淀形成的量和成骨标志蛋白OCN的表达水平均明显高于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）。综上所述，

关键词：胶原支架人牙髓干细胞纤维内硅化成骨分化骨再生

iRoot BP Plus对人牙髓干细胞增殖和分化的影响及其机制研究

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iRoot BP Plus对人牙髓干细胞增殖和分化的影响及其机制研究

作者：徐梅华北理工大学

学位级别：硕士

目的本课题旨在研究iRoot BP Plus对人牙髓干细胞(human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)增殖和成骨分化的影响及机制,以期为新型的生物活性材料iRoot BP Plus应用于活髓保存治疗提供基础研究依据。方法 1采用组织块加酶消化法分离培... 详细信息

目的本课题旨在研究iRoot BP Plus对人牙髓干细胞(human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs)增殖和成骨分化的影响及机制,以期为新型的生物活性材料iRoot BP Plus应用于活髓保存治疗提供基础研究依据。方法 1采用组织块加酶消化法分离培养人牙髓干细胞,流式细胞仪检测进行细胞鉴定。2制备浓度为5.56 mg/ml、11.11 mg/ml、33.33 mg/ml的iRoot BP Plus和三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate,MTA)浸提液。各浓度浸提液处理人牙髓干细胞48 h,通过CCK-8法检测人牙髓干细胞的增殖活性。3选取最佳浓度(33.33 mg/ml)的iRoot BP Plus和MTA分别作用人牙髓干细胞14 d,应用茜素红染色法观察iRoot BP Plus、MTA和对照组人牙髓干细胞矿化结节形成的情况。4采用qRT-PCR法检测各组人牙髓干细胞中成骨相关基因OC、BSP、COL-I的mRNA表达水平。5采用Western Blot检测各组人牙髓干细胞中MAPK信号通路蛋白ERK、JNK及其磷酸化蛋白p-ERK、p-JNK的表达。结果 1成功培养出人牙髓干细胞,显微镜下观察符合牙髓干细胞的形态,流式细胞仪检测结果显示CD44、STRO-1表达呈阳性,CD34表达呈阴性,符合人牙髓干细胞的特征。2 iRoot BP Plus和MTA各浓度均可显著提高人牙髓干细胞的增殖活性(P人牙髓干细胞增殖能力的影响高于相同浓度的MTA(P人牙髓干细胞中成骨基因OC、BSP、COL-I的mRNA相对表达量均显著高于对照组(P人牙髓干细胞中p-ERK和p-JNK的蛋白水平均显著高于对照组(P人牙髓干细胞增殖的作用优于相同浓度的MTA。2 iRoot BP Plus促进人牙髓干细胞的矿化能力的作用优于相同浓度的MTA。3 iRoot BP Plus可能是通过激活MAPK信号通路而上调下游成骨基因OC、BSP、COL-I的表达,进而促进人牙髓干细胞成骨分化。iRoot BP Plus对MAPK信号通路及下游基因的调控能力可能优于MTA。

关键词：人牙髓干细胞增殖成骨分化 MAPK信号通路

HA和HA/Ag-BG对人牙髓干细胞增殖分化及抗菌活性的影响

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HA和HA/Ag-BG对人牙髓干细胞增殖分化及抗菌活性的影响

作者：李亚辉华北理工大学

学位级别：硕士

目的探索新型生物活性材料——透明质酸(HA)和透明质酸—含银生物活性玻璃复合物(HA/Ag-BG)对人牙髓干细胞的增殖活性、促成牙本质细胞向分化的能力以及对变形链球菌和干酪乳杆菌的抗菌活性,以期获得能够促进牙体组织修复再生的理想材... 详细信息

目的探索新型生物活性材料——透明质酸(HA)和透明质酸—含银生物活性玻璃复合物(HA/Ag-BG)对人牙髓干细胞的增殖活性、促成牙本质细胞向分化的能力以及对变形链球菌和干酪乳杆菌的抗菌活性,以期获得能够促进牙体组织修复再生的理想材料。方法课题组的前期实验已筛选出1/20稀释浓度的HA和HA/Ag-BG浸提液作为促进人牙髓干细胞细胞活性的最适浓度,本实验将针对HA/Ag-BG对人牙髓干细胞增殖、向成牙本质细胞分化以及抗菌活性的影响做进一步研究。实验分为三部分:1 HA和HA/Ag-BG对人牙髓干细胞增殖的影响。将HA和Ag-BG按质量比1:1进行混合,配制HA/Ag-BG复合物。制备HA和HA/Ag-BG浸提液母液,使用含10%胎牛血清和1%青链霉素的Alpha-MEM完全培养基对浸提液母液进行稀释,得到1/20稀释浓度的HA和HA/Ag-BG浸提液备用。培养人牙髓干细胞并接种于96孔板,将接种细胞随机分为三组,细胞贴壁后弃原培养基,在三组中分别加入完全培养基、HA浸提液以及HA/Ag-BG浸提液继续培养,分别在第1、3、5、7天,应用CCK-8试剂盒检测人牙髓干细胞的增殖活性。2 HA和HA/Ag-BG对人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的影响。制备HA组、HA/Ag-BG组和对照组促分化培养基。培养人牙髓干细胞并接种于六孔板,接种细胞被随机分为三组,三组细胞与牙磨片共同孵育,在各组促分化培养基中培养21天后,提取各组细胞总RNA,采用Real-time PCR检测ALP、DMP1、DSPP、RUNX2基因m RNA的相对表达水平。3 HA和HA/Ag-BG抑制变形链球菌和干酪乳杆菌的能力。将等体积的PBS、HA浸提液和HA/Ag-BG浸提液分别与变形链球菌和干酪乳杆菌混合,37℃孵育24h,连续稀释至10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5梯度浓度后接种于琼脂平板,继续孵育48h后进行菌落计数。采用SPSS17.0的统计学软件对实验结果进行统计学分析,实验数据使用均数±标准差((?)±s)的形式表示。组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。各项实验重复三次。结果1 CCK-8法检测结果显示:人牙髓干细胞在常规培养基、HA浸提液和HA/Ag-BG浸提液培养的第1天和第3天时,三组细胞间的增殖活性未见明显差异(P>0.05);当继续培养至第5天和第7天时,HA组和HA/Ag-BG组分别与对照组相比,均未见明显差异(P>0.05),而HA/Ag-BG组表现出比HA组具备更高的增殖活性(P人牙髓干细胞,其ALP、DMP1、DSPP、RUNX2基因m RNA的表达水平均高于HA/Ag-BG组(P人牙髓干细胞增殖的能力。2 HA比HA/Ag-BG具有更高的促进人牙髓干细胞分化为成牙本质细胞的能力。3 HA和HA/Ag-BG对变形链球菌以及干酪乳杆菌的生长均可起到有效的抑制作用。

关键词：人牙髓干细胞 HA HA/Ag-BG 增殖分化抗菌活性

云南白药对人牙髓干细胞成骨/成牙本质向分化影响的体外研究

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云南白药对人牙髓干细胞成骨/成牙本质向分化影响的体外研究

作者：韩群超昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]研究云南白药对体外分离培养的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)成骨/成牙本质向分化过程中矿化结节形成和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、骨钙素(osteocalcin, OCN)及牙本质基质蛋白1 (dentin matrix protein 1, DMP1)表达的影响,为研究云南白药参与牙髓损伤修复机制以及云南白药应用于牙髓病临床治疗提供实验依据。[方法]采用组织块酶消化法从健康牙髓组织中培养获得原代hDPSCs,通过有限稀释法纯化细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标记物,分别进行成骨诱导和成脂诱导,检测其干细胞特性,进行细胞鉴定。取第4代DPSCs,空白对照组加入含10%FBS的α-MEM培养液,实验组加入含6个不同浓度云南白药的α-MEM培养液,云南白药浓度分别为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、 20μg/ml及40μg/ml,MTT法检测6个不同浓度的云南白药对hDPSCs的增殖的影响。同时,用茜素红染色观察6个不同浓度云南白药对hDPSCs矿化诱导中矿化结节形成的影响,空白对照组加入矿化诱导液,实验组分别加入含6个不同浓度云南白药：1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的矿化诱导液,于诱导的第3d、7d分别进行茜素红染色。根据以上实验结果选择10gg/ml的云南白药浓度进行hDPSCs定向分化实验,空白对照组加入矿化诱导液,实验组加入含10μg/m云南白药的矿化诱导液,于诱导的第3d、7d、14d进行茜素红染色,观察矿化结节形成情况,并于诱导的第3d、7d、14d采用RT-PCR检测lDPSCsALP、DSPP、OCN及DMP1的表达。[结果]通过组织块酶消化法于原代培养后3-5天见细胞从组织块边缘游出,用有限稀释法获得相对纯化均一的hDPSCs;流式细胞术分析细胞表面抗原标记结果显示,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;成骨诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成。MTT法检测云南白药对hDPSCs的增殖影响结果显示,1Oμg/ml云南白药组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);茜素红染色检测云南白药对hDPSCs矿化结节形成影响结果显示,10μg/ml云南白药组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR检测云南白药对hDPSCs矿化基因ALP、DSPP、OCN及DMP1表达影响结果显示,10μg/ml云南白药组ALP、DSPP、OCN及DMP1的表达量高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05).[结论]1.10μg/ml云南白药可促进hDPSCs的增殖;2. 10μg/ml云南白药可促进hDPSCs矿化结节的形成;3.10μg/ml云南白药可上调hDPSCs ALP、DSPP、OCN及DM MP1的表达。

关键词：人牙髓干细胞云南白药增殖成骨/成牙本质向分化

Biodentine在人牙髓干细胞增殖、迁移、黏附和分化中的作用及其相关机制的研究

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Biodentine在人牙髓干细胞增殖、迁移、黏附和分化中的作用及其相...

作者：罗志容第四军医大学

学位级别：硕士

龋病是口腔的常见病，多发病之一。当龋病发展至牙本质时，细菌及其分泌的毒性产物可通过牙本质小管侵入牙髓组织而导致其不同程度的损伤。当损伤较严重时，原有的成牙本质细胞死亡，牙髓发生炎症，随后牙髓组织中的牙髓干细胞（dentalp... 详细信息

龋病是口腔的常见病，多发病之一。当龋病发展至牙本质时，细菌及其分泌的毒性产物可通过牙本质小管侵入牙髓组织而导致其不同程度的损伤。当损伤较严重时，原有的成牙本质细胞死亡，牙髓发生炎症，随后牙髓组织中的牙髓干细胞（dentalpulp stem cells, DPSCs）增殖、迁移并黏附于损伤部位分化为成牙本质样细胞（odontoblast-like cells, OBLCs），分泌修复性牙本质，保护牙髓。因此DPSCs增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化是牙髓损伤修复和治疗的关键环节，这为研究牙髓牙本质复合体的再生提供了重大的契机。 Biodentine是牙髓治疗领域的一种新兴材料。其主要成分为硅酸三钙、碳酸钙、二氧化锆、硅酸二钙、氧化钙、氧化铁、氯化钙和高分子聚合物的还原剂。与三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate, MTA）相比，Biodentine硬固时间短、微渗漏低和机械性能强。作为盖髓剂能有效地隔绝外界因素刺激，保护牙髓组织，诱导DPSCs分化为OBLCs，形成牙本质样结构，其在牙髓损伤修复过程具有潜在的优势及临床应用前景。那么Biodentine能否诱导人牙髓干细胞的增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化能力，目前尚未见文献报道。因此，本课题在成功构建hDPSCs细胞系的基础上，研究Biodentine在hDPSCs的增殖、迁移、黏附以及成牙/成骨分化过程中的作用及其相关的分子机制，为将来临床活髓保存治疗和人牙髓干细胞组织工程应用提供新思路。主要的研究结果如下： 1.人牙髓干细胞的分离、培养和鉴定我们选取年轻患者因正畸拔除的新鲜健康第三磨牙，用组织块联合酶消化法分离和培养原代人牙髓细胞，有限稀释法挑选单克隆细胞，扩大培养获得人牙髓干细胞系。利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行鉴定，同时通过成骨、成脂诱导实验检测细胞的多向分化潜能，证明所培养的细胞为高纯度的人牙髓干细胞。 2. Biodentine对人牙髓干细胞增殖能力的影响制备Biodentine浸提液;通过MTT和BrdU实验检测不同时间点不同浓度Biodentine浸提液（0.02-20mg/ml）刺激二维平面hDPSCs后对其增殖能力的影响。MTT结果显示，不同浓度Biodentine培养hDPSCs1、3、5和7天，0.2mg/ml和2mg/ml的Biodentine均可显著促进该细胞的增殖能力，Biodentine浓度为0.02mg/ml时，细胞增殖与对照组比较没有明显的差异，而20mg/ml的Biodentine显著抑制hDPSCs的增殖，对其有毒性作用。BrdU结果显示，不同浓度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小时，其检测结果与MTT结果一致。 3. Biodentine对人牙髓干细胞迁移和黏附能力的影响我们通过细胞划痕和Transwell实验探索Biodentine对hDPSCs迁移的作用;采用细胞黏附实验确定Biodentine对hDPSCs黏附能力的影响;利用实时定量PCR技术进一步分析Biodentine诱导hDPSCs黏附和迁移过程中，细胞趋化因子和黏附分子mRNA表达的情况。通过细胞划痕和Transwell实验，我们发现0.2mg/ml的Biodentine明显促进hDPSCs的迁移能力;细胞黏附实验结果表明Biodentine浓度为0.2mg/ml时能显著提高hDPSCs的黏附作用。此外，实时定量PCR结果显示，0.2mg/ml的Biodentine可有效地影响细胞趋化因子和黏附分子在hDPSCs中的表达。 4. Biodentine在人牙髓干细胞分化中的作用及其相关机制研究首先，用不同浓度Biodentine分别矿化诱导hDPSCs1、3、7、10、14和21天，通过碱性磷酸酶试剂盒检测在细胞分化过程中碱性磷酸酶活性的变化。我们发现0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，而且14天时表达达到最高峰，提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期发挥重要的作用。然后我们通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色和实时定量PCR检测Biodentine对hDPSCs成牙/成骨向分化的影响。结果显示，0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine均可促进该细胞向成牙/成骨分化的能力，其中以0.2mg/ml Biodentine更为显著。以上结果证明Biodentine能有效地促进hDPSCs的成牙/成骨向分化，但是相关的分子机制尚不清楚。为了探索Biodentine调控hDPSCs成牙/成骨向分化的分子机制，我们进一步通过茜素红染色、实时定量PCR实验和蛋白质印迹技术，初步探讨如核因子κB（nuclearfactor-kapp

关键词： Biodentine 人牙髓干细胞增殖迁移黏附分化

整合素α5在人牙髓干细胞增殖、迁移及成骨/成牙本质向分化中的作用

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整合素α5在人牙髓干细胞增殖、迁移及成骨/成牙本质向分化中的作...

作者：徐帅妹南方医科大学

学位级别：硕士

牙髓组织是一种疏松的结缔组织,其血液供应来源于根尖孔细小的血管,无有效的侧支血液循环,很难抵御外界的炎症等刺激。牙髓组织的损伤通常是不可逆的,可导致牙髓组织坏死并进一步向根尖周组织进展。寻找一种理想的牙髓病治疗手段是口腔... 详细信息

牙髓组织是一种疏松的结缔组织,其血液供应来源于根尖孔细小的血管,无有效的侧支血液循环,很难抵御外界的炎症等刺激。牙髓组织的损伤通常是不可逆的,可导致牙髓组织坏死并进一步向根尖周组织进展。寻找一种理想的牙髓病治疗手段是口腔科医师的共同目标。传统的根管治疗通过彻底去除感染的牙髓组织,切削感染的根管内壁,利用充填材料严密充填根管系统。虽然可以基本去除感染物,减小再感染的机会,但仍有着明显的缺陷：第一,充填材料和密封材料易使牙冠变色而影响患者的容貌美观;第二,根管治疗后,牙本质的抗折性能明显降低;第三,患牙经过完善的根管治疗后,依然较健康牙容易缺失。因此,恢复天然牙结构与功能成为了一种治疗需求。当牙髓受到外界刺激时,存在于髓腔内的未分化间充质细胞可分化为成牙本质细胞,参与牙髓组织的损伤修复过程,这为牙髓病的治疗提供一种更好的方法。2000年,Gronthos等首先提出成人牙髓中存在具备自我更新和多向分化潜能的前体细胞——人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)。在正常情况下,hDPSCs处于静息状态;当外界刺激造成牙本质细胞受损时,hDPSCs可增殖并迁移至受损区域,分化为成牙本质细胞,形成修复性牙本质,从而参与牙髓组织的损伤修复过程。hDPSCs正常的生长、增殖、迁移及成牙本质细胞向分化对于损伤修复过程非常重要。牙髓再生是利用组织再生技术使牙髓组织再生,替代损伤的由成牙本质细胞、血管、连接组织和神经等构成的牙髓组织,恢复天然牙髓组织的一种探索性生物学技术。成牙本质细胞再生、牙髓血运重建、神经再生和支架移植是牙髓再生必须面对的问题。其中成牙本质细胞的再生是牙髓组织再生的核心。hDPSCs作为一种重要的种子细胞,可诱导分化为成牙本质细胞,而其在小鼠体内可诱导分化为牙髓牙本质样复合体,进一步提示了其在牙髓组织再生中的重要作用。整合素是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子,在人体各种组织中表达,介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用;参与细胞的迁移、增殖、分化、信号传递、肿瘤转移、伤口愈合及细胞对机械压力的应激等生理病理过程。整合素α5(integrin α5,ITGA5)属于整合素超家族,其与整合素β1结合,形成异二聚体发挥生理功能。整合素α5β1是纤粘连蛋白(fibronectin, FN)的受体,两者结合后可触发信号转导过程,激活多种信号分子,从而参与细胞增殖、黏附、迁移、细胞骨架重建、胚胎发育等生理过程;最近有研究证实其在骨髓间充质细胞骨向分化中发挥作用。1998年有学者首次报道了ITGA5在人牙髓细胞的表达,并证实了其在细胞黏附过程中发挥作用。然而,目前关于ITGA5在]DPSCs的功能研究报道很少,本研究旨在对ITGA5在hDPSCs增殖、迁移、成骨／成牙本质向分化过程中的作用进行研究,为进一步阐明牙髓组织的损伤修复、再生机制提供理论依据。本论文分为以下三部分内容：第一章：hDPSCs的分离培养与鉴定本实验通过获取健康的年轻恒牙,利用组织块酶消化法分离培养hDPSCs,实验中组织块能较为牢固的贴附于培养瓶底,显微镜下观察组织块贴壁情况良好,培养的5-10d可见细胞从组织块内游出。传代扩大培养细胞贴壁性能良好,可进行稳定的传代,细胞呈梭形,胞质透光性好。对于所获细胞进行细胞表型与生物学特性检测,结果显示所获细胞可形成单细胞克隆,可成脂、成软骨、成骨诱导分化,流式细胞仪检测间充质细胞表面标记物为阳性,造血细胞来源表面标记物为阴性,证实为间充质来源。本实验成功分离了hDPSCs并传代扩大培养,为后续实验提供了可靠的细胞来源。第二章：ITGA5在hDPSCs增殖、迁移过程中的作用本实验通过构建抑制ITGA5表达慢病毒载体,感染hDPSCs, qRT-PCR与western blot检测ITGA5表达情况;利用MTT、EdU检测抑制ITGA5表达后hDPSCs增殖能力;利用Transwell检测人抑制ITGA5表达后hDPSCs迁移能力。结果显示利用抑制ITGA5'慢病毒表达载体感染hDPSCs可获得较高的感染效率,qRT-PCR与western blot均表明ITGA5在hDPSCs表达量受到显著抑制;MTT、 EdU检测结果显示抑制ITGA5表达后hDPSCs增殖能力显著降低;Transwell实验结果显示抑制ITGA5表达后hDPSCs迁移能力显著降低。第三章：ITGA5在hDPSCs成骨／成牙本质向分化过程中的作用本实验通过qRT-PCR检测ITGA5在经矿化诱导的hDPSCs与正常培养的hDPSCs中的表达情况。通过构建抑制ITGA5表达慢病毒载体,感染hDPSCs,矿化诱导21d,茜素红

关键词：整合素α5 人牙髓干细胞细胞增殖细胞迁移成骨/成牙本质向分化

人牙髓干细胞、牙周膜干细胞表型及生长特性分析

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河北医药 2020年第1期42卷 99-101,105页

作者：庞真贞李硕刘钦赞李晔王良河北省保定市第一中心医院

目的探讨人牙周膜干细胞与人牙髓干细胞的表型及生长特性。方法2018年7至12月选择18~25岁因正畸拔除完整第三磨牙10颗。取牙周膜干细胞、牙髓干细胞进行培养、纯化、扩增。统计细胞生长增殖OD,STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、C... 详细信息

目的探讨人牙周膜干细胞与人牙髓干细胞的表型及生长特性。方法2018年7至12月选择18~25岁因正畸拔除完整第三磨牙10颗。取牙周膜干细胞、牙髓干细胞进行培养、纯化、扩增。统计细胞生长增殖OD,STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表达率,集落生成率。结果牙髓干细胞培养3 d出现快速生长,第9天后进入平台期;牙周膜干细胞在培养4 d后开始快速生长,第8天进入平台期。2组在3~12 d时,牙髓干细胞细胞增殖A值显著高于牙周膜干细胞,差异有统计学意义(P细胞STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105均呈高表达。2种细胞STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。牙髓干细胞集落形成率显著高于牙周膜干细胞,差异有统计学意义(P人牙髓干细胞与人牙周膜干细胞STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105均呈高表达,符合干细胞表型;人牙髓干细胞较人牙周膜干细胞增殖更快,集落形成率更高。

关键词：人牙周膜干细胞人牙髓干细胞表型生长特性