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淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

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淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响

作者：赵弼洲兰州大学

学位级别：硕士

目的：本实验在体外成功原代培养人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）的基础上,将含不同浓度淫羊藿苷（icariin,ICA）的矿化诱导培养液与其作用,通过检测其增殖,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性... 详细信息

目的：本实验在体外成功原代培养人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）的基础上,将含不同浓度淫羊藿苷（icariin,ICA）的矿化诱导培养液与其作用,通过检测其增殖,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）等骨相关特征性指标,以期明确淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响。方法： 1.采用胰酶消化玻片覆盖组织块法体外原代培养人牙周膜细胞,相差倒置显微镜观察其形态学特征,采用每日细胞计数法绘制细胞生长曲线;2.波形丝蛋白、角蛋白免疫细胞化学染色鉴定原代培养的人牙周膜细胞来源;3.在矿化诱导条件下培养人牙周膜细胞21d,行茜素红染色,以是否形成钙化结节评价其是否具有骨向分化能力;4.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用24h、48h、72h,采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）评价淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响;5.在矿化诱导条件下将浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml、0μg/ml的淫羊藿苷与人牙周膜细胞作用72h,通过检测ALP活性,Elisa法检查BSP、OCN的表达水平,评价其对人牙周膜细胞骨向分化的影响。结果： 1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,生长曲线可见,接种后24-48h,细胞数目有所减少,第3d细胞开始增殖,逐渐进入指数增殖期,接种后第7d,细胞数目达到最大值,第8d开始,细胞进入平台期。整个生长曲线呈现“S”形。按公式计算,得出细胞倍增时间约为90h。 2.原代培养人牙周膜细胞免疫细胞化学染色,波形丝蛋白染色阳性,表现为胞质棕黄色着色;角蛋白染色阴性,未见着色,说明是中胚层来源细胞。 3.矿化诱导培养第14d时,观察到细胞群中出现灰白色结节,随时间增长逐渐增大增多。第21d时结束培养行茜素红染色后可见,矿化诱导培养组形成多处红染矿化结节,而对照组仅可见到极少数红染矿化结节,原代培养的人牙周膜细胞可在矿化诱导条件下骨向分化： 4.淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖的影响：淫羊藿苷作用24h时,各药物浓度均能促进人牙周膜细胞增殖（P＜0.05）。作用48h时,1-0.001μg/ml组可明显增强人牙周膜细胞增殖能力（P＜0.05）,10μg/ml组OD值较对照组小,但差异无统计学意义（P＞0.05）。作用72h时,0.1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞增殖（P＜0.05）,10μg/ml组与对照组相比抑制了牙周膜增殖（P＜0.05）;5.淫羊藿苷对人牙周膜细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的影响：淫羊藿苷在矿化诱导条件下与人牙周膜细胞作用72h时,发现1-0.001μg/ml组可促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶（ALP）活性（P＜0.05）,而10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;6.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨涎蛋白（BSP）表达水平的影响：淫羊藿苷与人牙周膜细胞在矿化诱导条件下作用72h后,0.1～0.001μg/ml组的BSP表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05）。1 u g/ml与10μg/ml组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。 7.淫羊藿苷对人牙周膜细胞骨钙素（OCN）表达水平的影响：人牙周膜细胞在矿化诱导条件下与不同浓度淫羊藿苷作用72h后,1～0.01μg/ml组的OCN表达水平均较对照组显著增加（P＜0.05）,0.001μg/ml组的OCN表达水平较对照组高,但无统计学意义（P＞0.05）,10μg/ml组OCN表达水平较对照组低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论： 1.胰酶消化玻片覆盖组织块法可成功原代培养人牙周膜细胞,培养周期短、成功率高,其来源可靠,细胞生长状态良好;2.人牙周膜细胞中具有可骨向分化的细胞群;3.一定浓度的淫羊藿苷可促进人牙周膜细胞增殖和骨向分化。

关键词：淫羊藿苷人牙周膜细胞原代培养增殖骨向分化碱性磷酸酶骨涎蛋白骨钙素

骨碎补柚皮苷和三七总皂苷对人牙周膜细胞分化和超微结构的影响

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骨碎补柚皮苷和三七总皂苷对人牙周膜细胞分化和超微结构的影响

作者：吴静重庆医科大学

学位级别：硕士

目的研究骨碎补柚皮苷和三七总皂苷作用于人牙周膜细胞后，细胞分化和超微结构的影响，为进一步探讨其对人牙周膜细胞的作用提供实验基础。方法(1)体外分离培养人牙周膜细胞，运用组织块法;观察原代培养的人牙周膜细胞和传代培养的人... 详细信息

目的研究骨碎补柚皮苷和三七总皂苷作用于人牙周膜细胞后，细胞分化和超微结构的影响，为进一步探讨其对人牙周膜细胞的作用提供实验基础。方法(1)体外分离培养人牙周膜细胞，运用组织块法;观察原代培养的人牙周膜细胞和传代培养的人牙周膜细胞形态特征，免疫组化检测细胞表面标志物，对人牙周膜细胞进行鉴定;(2)采用MTT法检测不同浓度骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用于人牙周膜细胞后，细胞增殖情况;(3)采用酶动力法检测骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用于人牙周膜细胞后，碱性磷酸酶活性的变化;(4)采用Western blot法检测骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用于人牙周膜细胞后，细胞碱性磷酸酶表达;(5)观察骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用于人牙周膜细胞后超微结构的变化运用透射电镜。结果(1)组织块法培养所得细胞经过表型免疫组化鉴定：波形丝蛋白在人牙周膜细胞内表达阳性，角蛋白在人牙周膜细胞内表达阴性。(2)实验组细胞增殖显著高于对照组，骨碎补柚皮苷增殖最明显的质量浓度为1mg.L，三七总皂苷以1mg.L质量浓度下增殖最明显，骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用后，较其余药物组增殖明显。(3)骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷联合三七总皂苷均能促进碱性磷酸酶活性增强，活性作用增强最明显为骨碎补柚皮苷联合三七总皂苷组。(4)骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷联合三七总皂苷作用于人牙周膜细胞后，碱性磷酸酶表达优于对照组，表达作用最明显为两药联合用药组。(5)骨碎补柚皮苷、三七总皂苷、骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用下，核糖体、粗面内质网较对照组明显增多，联合用药组最明显。结论骨碎补柚皮苷和三七总皂苷联合作用于人牙周膜细胞，对其成骨分化和超微结构具有协同作用。

关键词：人牙周膜细胞骨碎补柚皮苷三七总皂苷分化超微结构

NGF和rhBMP对人牙周膜细胞增殖与ALP活性的影响

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NGF和rhBMP对人牙周膜细胞增殖与ALP活性的影响

作者：石瑾山西医科大学

学位级别：硕士

目的:观察不同浓度的神经生长因子(NGF)和重组骨形态发生蛋白(rhBMP)分别及联合作用对体外培养的人牙周膜细胞(PDLCs)增殖及碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。为生长因子应用于临床牙周病的治疗提供理论基础。方法:(1)体外传代培养人牙周膜... 详细信息

目的:观察不同浓度的神经生长因子(NGF)和重组骨形态发生蛋白(rhBMP)分别及联合作用对体外培养的人牙周膜细胞(PDLCs)增殖及碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。为生长因子应用于临床牙周病的治疗提供理论基础。方法:(1)体外传代培养人牙周膜细胞。(2)采用四唑盐比色法(MTT)和酶动力学方法,观察不同浓度的神经生长因子和重组骨形态发生蛋白分别及联合作用对体外培养的人牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用。(3)动态观察神经生长因子和重组骨形态发生蛋白联合作用对人牙周膜细胞的促增殖影响。结果:(1)NGF和rhBMP分别及联合作用均能促进PDLCs的增殖(P0.05)。表明其促增殖作用并不是呈现连续递增趋势。结论: NGF和rhBMP分别及联合作用均能促进人PDLCs的增殖和碱性磷酸酶活性,NGF和rhBMP联合作用能更显著地促进人PDLCs的增殖和碱性磷酸酶活性。其中NGF(10) + rhBMP(200)为最佳显效浓度。动态观察NGF(l0) + rhBMP(200)作用于人PDLCs 1——9d,其促增殖作用并不是呈现连续递增趋势。

关键词：人牙周膜细胞神经生长因子重组骨形态蛋白

盐酸小檗碱对人牙周膜细胞生物学活性及大鼠牙周组织IL-1β、TNF-α表达的影响

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盐酸小檗碱对人牙周膜细胞生物学活性及大鼠牙周组织IL-1β、TNF-...

作者：张小恒兰州大学

学位级别：硕士

目的：1、研究玻片覆盖法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率及生物学性状;在此基础上研究盐酸小檗碱对原代培养的人牙周膜细胞生物学活性的影响。2、研究盐酸小檗碱对大鼠实验性牙周炎模型的牙周组织中TNF-α、IL-1β表达的影响。方法... 详细信息

目的：1、研究玻片覆盖法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率及生物学性状;在此基础上研究盐酸小檗碱对原代培养的人牙周膜细胞生物学活性的影响。2、研究盐酸小檗碱对大鼠实验性牙周炎模型的牙周组织中TNF-α、IL-1β表达的影响。方法：1、利用形态学、免疫组化方法、生长曲线测定来观察玻片覆盖法原代培养人牙周膜成纤维细胞的成功率其生物学特性，并鉴定其来源，在体外培养人牙周膜成纤维细胞的基础上，采用噻唑蓝(MTT)比色法、考马斯亮蓝法、酶动力学方法探讨盐酸小檗碱对原代培养的人牙周膜细胞增殖活性、蛋白合成、碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。2、在成功建立大鼠实验性牙周炎模型的基础上，实验动物分别灌服盐酸小檗碱后第1、2、3、4周处死(每次每组5只)，取牙周组织标本作切片，行常规HE染色，观察牙周组织病理变化状况，并采用免疫组织化学法检测IL-1、TNF-α水平变化。结果：1、玻片覆盖法可显著提高人牙周膜细胞原代培养的成功率。2、盐酸小檗碱对牙周膜细胞生长增殖的影响：与对照组比较，作用24小时，盐酸小檗碱组(A，B，C，D组)均能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P＜0.05)，而E组与对照组比较无统计学意义;作用48小时，盐酸小檗碱组(A，B，C组)均能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P＜0.05)，而D、E组与对照组比较无统计学意义：作用72小时，盐酸小檗碱组(B，C组)均能明显增强人牙周膜细胞增殖能力(P＜0.05)，而A、D、E组与对照组比较无统计学意义。而且盐酸小檗碱在10-20 mg／L浓度范围内作用时间最长。3、盐酸小檗碱对牙周膜细胞蛋白含量的影响：盐酸小檗碱组(A，B，C组)细胞培养液中蛋白总含量均明显高于对照组(P＜0.05)，而盐酸小檗碱组(D，E组)与对照组比较无统计学意义。4、盐酸小檗碱对牙周膜细胞ALP活性的影响：盐酸小檗碱组(B，C组)细胞培养液中ALP活性均明显高于对照组(P＜0.05)，而盐酸小檗碱组(A，D，E组)与对照组比较无统计学意义，5、牙周炎组牙周组织中IL-1β、TNF-α表达明显高于正常组(P＜0.05);各时间段牙周炎治疗组牙周组织中IL-1β、TNF-α表达明显低于牙周炎组(P＜0.05)，但牙周炎治疗组各时间段之间IL-1β、TNF-α表达无明显差异。结论：玻片覆盖法可显著提高人牙周膜细胞原代培养的成功率。盐酸小檗碱在一定浓度范围内(10-20mg／L)能提高牙周膜细胞的增殖活性、蛋白合成及ALP活性。大鼠实验性牙周炎模型牙周组织中TNF-α、IL-1β含量较正常对照组明显升高，应用盐酸小檗碱能抑制实验性牙周炎模型牙周组织中TNF-α、IL-1β的表达。根据上述结果证实盐酸小檗碱可促进创伤愈合和组织再生，从而为牙周病临床的合理用药提供科学依据。

关键词：盐酸小檗碱人牙周膜细胞碱性磷酸酶 TNF-α 牙周炎模型

牵张应力对人牙周膜细胞NF-κB信号通路的影响及其与MMP-2表达的关系

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牵张应力对人牙周膜细胞NF-κB信号通路的影响及其与MMP-2表达的...

作者：李燕山西医科大学

学位级别：硕士

目的：通过胶原酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞并构建细胞牵张应力加载模型，研究牵张应力对人牙周膜细胞NF-κB信号通路的影响及其与MMP-2表达的关系. 方法：①胶原酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞，观察人牙周膜细胞生物学特性... 详细信息

目的：通过胶原酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞并构建细胞牵张应力加载模型，研究牵张应力对人牙周膜细胞NF-κB信号通路的影响及其与MMP-2表达的关系. 方法：①胶原酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞，观察人牙周膜细胞生物学特性，免疫组织化学对细胞进行抗角蛋白及抗波形蛋白抗体检测判定其来源，并构建细胞牵张应力加载模型。 ②选取4-6代细胞，对细胞施加不同时间的12%周期性牵张应力，结合信号通路抑制剂及蛋白印迹的检测方法，研究不同应力条件对人牙周膜细胞NF-κB、IκB、 MMP-2蛋白的表达、IKK激酶的活性及磷酸化水平的影响，及MMP-2在人牙周膜细胞中表达的可能的信号转导通路。结果：①胶原酶消化法体外成功分离培养人牙周膜细胞，免疫组织化学鉴定其来源可靠;应用多通道细胞牵张应力加载系统成功构建人牙周膜细胞体外培养-力学刺激模型。 ②蛋白印迹结果显示：人牙周膜细胞受到12%形变率的周期性牵张应力作用时，NF-κB信号通路被激活， p-IKK磷酸化程度升高，与对照组相比均具有显著性差异（P牙周膜细胞受到12%形变率的周期性牵张应力作用时，MMP-2蛋白的表达增加，与对照组相比具有显著性差异（P牙周膜细胞MMP-2表达的增加，与单纯加力组相比差异具有统计学意义（P人牙周膜细胞并构建hPDLCs-力学刺激模型。 ②12%形变率的周期性牵张应力作用于牙周膜细胞时，NF-κB通路被激活，胞浆I-κBα蛋白表达水平的降低，I-κBα降解是NF-κB信号通路激活的机制之一。 ③12%形变率的周期性机械牵张应力可诱导人牙周膜细胞MMP-2的表达增加，从而影响牙周组织细胞外基质代谢同时机械牵张应力可通过NF-κB通路影响MMP-2蛋白的表达。

关键词：牵张应力人牙周膜细胞 NF-κB通路基质蛋白金属-2 蛋白印迹

人牙周膜细胞OPG与RANKL在mRNA水平的表达

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口腔正畸学 2002年第4期9卷 175-177页

作者：杨雁琪张丁李小彤傅民魁北京大学口腔医学院正畸科 100081

目的研究人牙周膜细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及破骨细胞分化因子(receptor acti-vator nuclear factor kappa B ligand,RANKL)信使RNA(messenger RNA,mRNA)的表达。方法系列酶消化法体外培养人牙周膜细胞,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞OPG和RANKL两种骨代谢因子的表达。结果正常人牙周膜细胞在mRNA水平表达OPG和RANKL。结论人牙周膜细胞表达OPG和RANKL参与骨组织代谢。这一结论为进一步研究人牙周膜细胞在机械力作用下参与骨改建的机理打下基础。

关键词：人牙周膜细胞 OPG RANKL mRNA RT-PCR 口腔正畸

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人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究

广东牙病防治 2011年第12期19卷 631-634页

作者：刘娟孟波赵华赵红宇谢宝仪广东省口腔医院.南方医科大学附属口腔医院广东广州510280

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周... 详细信息

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96%(24/25),细胞生长状态良好;应用酶解组织块法成功率80%(16/20);应用酶消化法成功率75%(12/16)。结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高。

关键词：人牙周膜细胞细胞培养牙周组织

人牙周膜细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞的研究

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口腔医学研究 2006年第2期22卷 133-136页

作者：韩劼孟焕新唐军民唐岩张凤秋李盛林北京大学口腔医学院牙周科北京100081 北京大学医学部组织胚胎系北京大学口腔医学院口腔颌面外科实验室北京100081

目的:体外定向诱导人牙周膜细胞分化为脂肪细胞,探讨人牙周膜细胞的多向分化潜能。方法:体外分离、培养人牙周膜细胞,用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和胰岛素诱导其向脂肪细胞定向分化。倒置相差显微镜、透射电子... 详细信息

目的:体外定向诱导人牙周膜细胞分化为脂肪细胞,探讨人牙周膜细胞的多向分化潜能。方法:体外分离、培养人牙周膜细胞,用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和胰岛素诱导其向脂肪细胞定向分化。倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察形态结构的变化,采用油红O染色法进行鉴定。结果:经成脂诱导分化培养后6 d,人牙周膜细胞内有脂滴出现。随着诱导培养时间的延长,脂滴逐渐增多并融合成脂泡,细胞由梭形变为圆形和椭圆形,体积增大。透射电子显微镜下见脂泡。油红O染色显示细胞内有中性脂肪形成。结论:人牙周膜细胞在体外可以分化为脂肪细胞,具有多向分化的潜能。

关键词：人牙周膜细胞脂肪细胞诱导分化

人牙周膜细胞及炎症龈组织中mCD14表达的免疫组化研究

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现代口腔医学杂志 2004年第5期18卷 389-391页

作者：张凤秋吴织芬万玲杨连甲臧晓霞第四军医大学口腔医学院牙周粘膜科西安710032

目的　研究人PDLC及炎症龈组织中mCD14表达情况。方法　采用免疫组化SABC方法。结果　正常人牙周膜细胞mCD14染色为阳性反应 ,但细胞经脂多糖刺激 2天后 ,胞浆染色要比未刺激的细胞染色深。健康牙龈组织中mCD14表达阴性 ;边缘性龈炎和... 详细信息

目的　研究人PDLC及炎症龈组织中mCD14表达情况。方法　采用免疫组化SABC方法。结果　正常人牙周膜细胞mCD14染色为阳性反应 ,但细胞经脂多糖刺激 2天后 ,胞浆染色要比未刺激的细胞染色深。健康牙龈组织中mCD14表达阴性 ;边缘性龈炎和牙周炎龈组织上皮棘层细胞mCD14呈强阳性表达 ,增生性龈炎也呈阳性表达。结论　mCD14可在非髓样细胞中表达 ;

关键词： CD14 表达人牙周膜细胞炎症免疫组化刺激胞浆增生性龈炎阳性反应上皮