检索结果-南通市图书馆

中国免疫学杂志 2012年第1期28卷 67-70页

作者：聂纪芹汪龚泽刘朝奇三峡大学分子生物学研究所宜昌443002

目的:构建人源annexina2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体。方法:从GenBank(BC093056.1)中获得人源annexina2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码an-nexinA2基因部分序列,将其... 详细信息

目的:构建人源annexina2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体。方法:从GenBank(BC093056.1)中获得人源annexina2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码an-nexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexina2的蛋白。表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot鉴定。用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexina2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度。在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexina2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性。结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexina2构建成功,可在大肠杆菌*** BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexina2蛋白。纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA滴度达1∶640 000)。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexina2有高度特异的结合活性。结论:构建了annexina2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexina2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础。

关键词：人源annexina2基因片段原核表达蛋白纯化多克隆抗体

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