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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化

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世界华人消化杂志 2008年第11期16卷 1144-1150页

作者：叶刚杨冬华汤绍辉黄卫丁世华罗静兰暨南大学附属第一医院内科广东省广州市510632

目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,... 详细信息

目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬菌体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×105,包含由25不同重链和22不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM33个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM11.6mol/L、HDM21.2mol/L和HDM32.2mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.

关键词：人源化单链抗体组合抗体库肝癌重叠延伸PCR 硫氰酸盐洗脱法酶联免疫吸附试验噬菌体展示技术

人骨髓及脐血单个核细胞移植构建人源化非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠模型:可以提高其人源化水平吗

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第32期13卷 6249-6254页

作者：赖颖晖赖永榕王明月杨高晖广西医科大学第一附属医院血液科广西壮族自治区南宁市530021

背景:人源化非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠模型在生物及医学科学研究中被广泛应用,而提高人源化NOD/SCID小鼠模型中的人源化水平是研究者的迫切需要。目的:探讨提高... 详细信息

背景:人源化非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID)小鼠模型在生物及医学科学研究中被广泛应用,而提高人源化NOD/SCID小鼠模型中的人源化水平是研究者的迫切需要。目的:探讨提高人源化NOD/SCID小鼠模型人源化水平的措施。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-11/2009-01在广西医科大学实验动物中心及广西医科大学第一附属医院完成。材料:雄性NOD/SCID小鼠14只,体质量(25.0±1.5)g;1例骨髓标本约6mL(多部位分层次采集)取自健康志愿者;1例足月脐带血标本大约90mL,取自广西医科大学第一附属医院产科,为健康产妇。方法:无菌抗凝的正常骨髓及足月脐带血样本均在采集后6h内处理。密度梯度离心法分离单个核细胞。将14只小鼠标号电脑随机分为5组:全身照射/环磷酰胺骨髓移植组(n=3),全身照射/环磷酰胺脐血移植组(n=3),全身照射骨髓移植组(n=3),全身照射脐血移植组(n=3),空白对照组(n=2)。将人骨髓或脐血单个核细胞分别移植给经不同方案和剂量预处理的各组小鼠,移植后给小鼠腹腔注射重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子及重组人促红细胞生成素。主要观察指标:各组小鼠输注的细胞数,小鼠存活情况并计算死亡率,移植6周后流式细胞仪检测小鼠骨髓及外周血人CD45+细胞比例。结果:全身照射/环磷酰胺骨髓移植组、全身照射骨髓移植组和全身照射/环磷酰胺脐血移植组、全身照射脐血移植组小鼠输注人单个核细胞数分别为(0.6560±0.0089)×106和(4.0775±0.8450)×106。全身照射/环磷酰胺组死亡率均为100%,全身照射组死亡率均为33.3%。全身照射后再加环磷酰胺,小鼠不能耐受;而全身照射剂量越大,死亡率越高,当达400cGy时,死亡率100%。存活小鼠移植6周后,流式细胞仪检测小鼠骨髓中人CD45+细胞的比例,全身照射脐血移植组13号和6号小鼠分别为59.61%和21.46%,而全身照射骨髓移植组2号和8号小鼠其比例均为0,空白对照组小鼠比例均为0。而在13号小鼠骨髓细胞中,CD33+细胞比例为13.13%,GlyA+CD45-细胞比例为20.21%。结论:要建立人源化NOD/SCID小鼠模型,所输入的造血干细胞数量一定要达到阈剂量,而在可耐受的范围内,尽可能提高预处理的强度,并使用人细胞因子可提高人源化NOD/SCID小鼠模型的人源化比例。

关键词：动物模型 NOD/SCID小鼠人源化细胞移植

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酵母表达人源化糖蛋白研究进展

中国生物工程杂志 2007年第4期27卷 120-125页

作者：王黎刘洋陈敏山东大学威海分校海洋学院威海264209 山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室济南250100

与人体天然复杂型糖蛋白相比,使用酵母生产的药用蛋白带有高甘露糖型N-糖链。这一差异在临床应用中产生了许多不良影响。目前,可以通过消除酵母特有的内源糖基化反应,引入哺乳动物细胞中的一系列糖基转移酶及转运蛋白对酵母糖基化路径... 详细信息

与人体天然复杂型糖蛋白相比,使用酵母生产的药用蛋白带有高甘露糖型N-糖链。这一差异在临床应用中产生了许多不良影响。目前,可以通过消除酵母特有的内源糖基化反应,引入哺乳动物细胞中的一系列糖基转移酶及转运蛋白对酵母糖基化路径进行改造,从而使其表达出人源化的复杂型N-聚糖。介绍酵母N-糖基化特点、糖基化不均一性;综述近年来利用基因工程改造酵母N-糖基化路径获得特定的人源N-连接糖蛋白以及使用内切糖苷酶生产人源糖蛋白的研究进展;对存在的问题及今后的发展前景进行讨论。

关键词：酵母糖基化人源化糖蛋白基因工程

重组人源化抗人HGF单克隆抗体鉴定及其抗肿瘤活性研究

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免疫学杂志 2017年第5期33卷 437-442页

作者：姚志伟李丹马保瑞张杰孙春昀谢良志盖文琳盛望北京工业大学生命科学与生物工程学院 100022 神州细胞工程有限公司北京100176

目的对人源化抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)单克隆抗体进行初步鉴定,并对其体内、外抗肿瘤活性及药代动力学特征进行研究。方法将基因工程技术制备的2株抗HGF人源化单克隆抗体HE19-12和HD19-27,通过UV、SDS-PAGE方法... 详细信息

目的对人源化抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)单克隆抗体进行初步鉴定,并对其体内、外抗肿瘤活性及药代动力学特征进行研究。方法将基因工程技术制备的2株抗HGF人源化单克隆抗体HE19-12和HD19-27,通过UV、SDS-PAGE方法对其质量浓度、相对分子质量及纯度进行鉴定;MTT法评价抗体对人脑胶质瘤U87MG细胞的增殖抑制活性,并比较抗体人源化前后活性差异;采用ELISA法评价抗体结合HGF及竞争抑制HGF与受体结合的能力;Transwell法研究抗体对HGF促进PC-3细胞迁移的抑制能力;通过构建U87MG裸鼠移植瘤模型,比较抗体在体内的抗肿瘤作用;抗体通过静脉给予正常小鼠,分析其药代动力学特征。结果 2株抗体单体纯度均达到90%以上,均可抑制U87MG肿瘤细胞增殖,且人源化前后抗体活性差异不大。2株抗体均与HGF具有较强的结合能力,且可竞争抑制HGF与其受体C-Met的结合。细胞迁移实验显示,2株抗体具有抑制HGF促肿瘤细胞迁移的能力。裸鼠移植瘤试验显示HGF抗体可有效抑制肿瘤的生长,其中HE19-12在试验中显示更好的抗肿瘤活性。小鼠药代结果显示,HE19-12和HD19-27的半衰期分别为423.3 h和342.5 h。结论成功对制备出的2株人源化单克隆抗体进行初步鉴定及一系列抗肿瘤活性研究,证明具有较强抗肿瘤活性的HGF中和抗体,且具有良好的药代动力学特征,为HGF/C-Met靶点抗肿瘤药物的开发奠定基础。

关键词： HGF 人源化单克隆抗体抗肿瘤

应用CRISPR/Cas9技术构建Tet-on调控表达uPA的人源化肝细胞嵌合小鼠

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陆军军医大学学报 2023年第13期45卷 1405-1412页

作者：白家驷毛青陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院传染病研究所重庆市传染病研究重点实验室重庆400038

目的构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。方法采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑... 详细信息

目的构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。方法采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑,插入目的基因pTight-uPA-pA-Alb promoter-rtTA-pA表达框。使目的基因能跟随染色体稳定遗传,生物学功能保持稳定。新培育的转基因小鼠分为4组:诱导组(n=17)、移植组(n=16)、未诱导组(n=5)和空白对照组(n=5)。诱导组经强力霉素诱导3周,肝脏中表达的uPA能造成小鼠肝脏亚急性损伤;再通过人肝癌细胞移植修复。移植4周后,通过小鼠血清生化学、组织病理学,评估该人源化肝细胞嵌合小鼠的效果。结果诱导组小鼠血清中uPA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均高于未诱导组和空白对照组(P人源化肝细胞嵌合小鼠。

关键词： CRISPR/Cas9技术 Rosa26基因位点人源化嵌合肝转基因小鼠尿激酶纤溶酶原激活物

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)敲除和人源化小鼠模型的建立

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中国实验动物学报 2021年第3期29卷 307-315页

作者：黄艺滢张文龙石桂英雷雪裴高苒白琳国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心北京100021

目的建立细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)基因人源化小鼠模型,为靶向CTLA4的肿瘤治疗性抗体研发和筛选提供有效的小鼠模型。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立CTLA4基因人源化和敲除小鼠模型,利用PCR、RT-PCR、Western Blot、免疫组织化... 详细信息

目的建立细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)基因人源化小鼠模型,为靶向CTLA4的肿瘤治疗性抗体研发和筛选提供有效的小鼠模型。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立CTLA4基因人源化和敲除小鼠模型,利用PCR、RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学和流式细胞术的方法对其进行鉴定及分析。将小鼠黑色素瘤细胞株(B16)注射到CTLA4人源化小鼠皮下,观察腹腔注射CTLA4单克隆抗体伊匹木(ipilimumab)的抗肿瘤效果。结果CTLA4人源化小鼠可以稳定表达人源CTLA4,而不表达鼠源CTLA4。CTLA4人源化小鼠出生后6个月内正常存活,组织病理学及免疫系统未见明显异常。同时在CTLA4人源化小鼠中,伊匹木减缓肿瘤生长速度。CTLA4基因敲除小鼠不表达CTLA4基因,在出生后3~5周内由于自身免疫疾病死亡。结论同时建立了CTLA4人源化和敲除小鼠。CTLA4人源化小鼠可用于筛选与CTLA4基因相关的治疗性抗体或药物。

关键词：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 人源化基因敲除小鼠

B细胞表位人源化的猪ZP4在大肠杆菌中的表达与鉴定

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中国免疫学杂志 2005年第11期21卷 826-827页

作者：袁敏敏李大金周雷王明雁朱影孟毅复旦大学妇产科研究所生殖免疫室上海200011

近年来,以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已从最初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展.Minoru等发现用人工合成的LDPENLTL八肽B细胞表位片段与外源性T细胞表位所得嵌合肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合试验,但对人精卵结合试... 详细信息

近年来,以卵透明带为靶抗原的疫苗制备已从最初的卵透明带及其组分水平向更高层次发展.Minoru等发现用人工合成的LDPENLTL八肽B细胞表位片段与外源性T细胞表位所得嵌合肽免疫小鼠所得抗血清可有效抑制猪精卵结合试验,但对人精卵结合试验却效果甚差.[第一段]

关键词： B细胞细胞表位人源化猪 ZP4 大肠杆菌基因表达鉴定方法疫苗

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人源化抗CD38抗体制备及生物学功能研究

人源化抗CD38抗体制备及生物学功能研究

作者：周远清华南理工大学

学位级别：硕士

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一类进展性、致命的疾病,其主要特征是骨髓中的浆细胞恶性增殖及抗体或者轻链蛋白过度表达,此类疾病严重影响着人类生存质量及预期寿命,针对此类疾病的治疗目前主要以化学小分子药物为主的化疗,此... 详细信息

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一类进展性、致命的疾病,其主要特征是骨髓中的浆细胞恶性增殖及抗体或者轻链蛋白过度表达,此类疾病严重影响着人类生存质量及预期寿命,针对此类疾病的治疗目前主要以化学小分子药物为主的化疗,此类药物化疗及放疗的毒副作用明显。尽管近年来针对MM的药物极大地改善了总生存期(OS),但MM仍是不可治愈的,MM病人的需求远未得到满足。白细胞分化群38(cluster of differentiation 38,CD38)在淋巴、骨髓细胞以及非造血细胞来源的某些组织低表达;在多发性骨髓瘤恶性肿瘤细胞上高表达。从CD38在细胞信号传导中扮演的角色表明,在MM的治疗中,CD38具有作为单克隆抗体药物靶点的价值。本论文利用真核表达系统制备了CD38胞外蛋白(CD38 ECD)及CHO-CD38FL全长稳定细胞系。将蛋白、细胞系交替免疫BALB/c小鼠,血清效价满足要求后用微量蛋白免疫脾脏,处死小鼠取脾脏分离B细胞,在PEG作用下与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14融合,分别用蛋白(CD38 ECD)、细胞(CHO-CD38FL、Daudi)通过ELISA、流式细胞仪进行筛选,阳性杂交瘤经过2轮有限稀释得到亚克隆细胞系。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,制备腹水,得到鼠源抗体。利用流式细胞仪测定了抗体与CD38阳性肿瘤细胞Daudi的亲和力,同时用Fortebio测定抗体于CD38 ECD的亲和力,在体外水平评价了蛋白的抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)及补体效应(CDC)。提取杂交瘤细胞总RNA反转录为cDNA,分别在轻链、重链前导肽序列及恒定区序列设计简并引物,通过PCR扩增得到目的基因,与T载体连接、转化、测序得到鼠源序列。abysis、Ig blast数据库比对,确定轻链、重链的CDR区、FR区及可变区家族类型,在IMGT免疫蛋白数据库比对鼠源FR区、人FR区,找到同源性最高的人FR区,保留鼠源CDR区,用人FR区取代鼠源FR区实现抗体人源化,测定了人源化后的抗体的亲和力、ADCC、CDC。制备的CD38 ECD,分子大小与预期结果一致(45kD),CHO-CD38FL能够与抗CD38抗体结合。经过4轮免疫,5只小鼠血清效价全部达到1:10,符合融合要求。经融合、筛选、亚克隆后得到2株细胞系,分别为38A3、38C5。2株杂交瘤制备腹水,纯化后分别得到大约15mg、18mg抗体,纯度分别为95.31%、94.92%。38A3、38C5及阳性对照与Daudi细胞的亲和力,分别为3.09nM、13.72nM、4.46nM,而抗体与CD38 ECD的亲和力分别为4.12nM、6.63nM、4.36nM。ADCC效应方面,38A3、38C5、阳性抗体的最大杀伤效果分别为38.567%、34.499%、37.771%,IC值分别为1.464ng/ml、0.1661ng/ml、0.1473ng/ml,。CDC效应方面,3者的IC50接近,分别为0.01792μg/ml、0.01429μg/ml、0.02267μg/ml。鼠源抗体38C5利用CDR移植方法进行了人源化,人源化后,抗体的亲和力、ADCC、CDC分别为11.2nM,0.5708ng/ml,0.04829μg/ml。

关键词： CD38 单克隆抗体亲和力抗体依赖细胞毒作用补体效应人源化

新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测

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军事医学 2014年第11期38卷 875-878页

作者：贾茹靳彦文李平刘萱高婷刘子敬曹诚安徽大学生命科学学院合肥230039 军事医学科学院生物工程研究所北京100850

目的制备新型人源化抗CD20单克隆抗体并检测其与CD20抗原的亲和力和抗肿瘤活性。方法通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与利妥昔单抗(rituximab)空间结构最相近的人Ig G1为骨架,将利妥昔单抗的互补决定区(complementarity de... 详细信息

目的制备新型人源化抗CD20单克隆抗体并检测其与CD20抗原的亲和力和抗肿瘤活性。方法通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与利妥昔单抗(rituximab)空间结构最相近的人Ig G1为骨架,将利妥昔单抗的互补决定区(complementarity determining region,CDR)进行移植和改造,通过重叠PCR方法,扩增出目的基因片段。分别将轻链(L)、重链(H)基因片段克隆到载体pc DNA3.3、p Opti VEC质粒上。瞬时转染至293F细胞,收取细胞上清,用r Protein A亲和层析法纯化目的抗体,并用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检验抗体的纯度和表达量,采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力,最后通过裸鼠移植瘤生长抑制实验检测抗体的抗肿瘤活性。结果构建了3种抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为两条相对分子质量约为25×103和55×103的条带,与预计条带大小相符;Fortebio实验结果表明,3组抗体与抗原具有良好的亲和活性:利妥昔单抗、L4H7抗体、L5H5抗体和L5H7抗体的Kd值分别为6.48×10-9、1.91×10-9、7.35×10-10和1.91×10-9mol/L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明,L5H7抗体的抗肿瘤活性优于利妥昔单抗。结论成功构建并表达了3种抗CD20人源化抗体,其中L5H7抗体具有良好的抗原结合能力和抗肿瘤活性。

关键词：抗原,CD20 抗体,单克隆人源化