检索结果-南通市图书馆

作者：邓小梅苏州大学

学位级别：硕士

我国每年有上千万烧伤病人,其中轻度烧伤的患者尚可通过其深层未受创部分为模板进行皮肤修复,但深度烧伤的病人,汗腺不能通过皮下剩余正常的组织向上进行后期修复,严重影响了烧伤患者的生活质量。因此汗腺细胞应用于组织工程皮肤构建和... 详细信息

我国每年有上千万烧伤病人,其中轻度烧伤的患者尚可通过其深层未受创部分为模板进行皮肤修复,但深度烧伤的病人,汗腺不能通过皮下剩余正常的组织向上进行后期修复,严重影响了烧伤患者的生活质量。因此汗腺细胞应用于组织工程皮肤构建和皮肤损伤修复的研究已成为热点。汗腺细胞生物学特征和汗腺再生研究启步较晚,近年来针对如何有效促进汗腺细胞体外增殖,维持汗腺细胞生物学特征和功能的研究还在探索中。目前国际上用于培养汗腺细胞的培养基分为有血清和无血清两类培养基,但其扩增和传代及培养体系尚不完善。本文旨在比较不同培养基对于维持汗腺细胞生物学特征和增殖能力的基础上,进一步探索血清和音猬基因(Sonic Hedgehog)在汗腺体外培养条件中的作用和机制,进而优化人汗腺细胞体外培养的条件。第一部分血清在人汗腺细胞体外培养条件中的作用和机制目的:比较含血清和无血清培养基对汗腺细胞生物学特征和功能的影响,并探讨血清在汗腺细胞培养基中的作用和机制。方法:利用手术废弃的六指全层皮肤,去除表皮后,在倒置显微镜下分离出汗腺组织,并将其培养在含血清的SG培养基中(DMEM/F12+10%FBS,h EGF,Hydrocortison,Triiodothyronine,Insulin-Transferrin-selenium)。约一周后,待汗腺细胞向外增殖,将增殖的汗腺细胞分别培养在SG培养基,KGM-2培养基(KBM-2,BPE,insulin,hydrocortisone,transferrin,epinephrine,GA-100)和SG:KGM-2为1:1的混合培养基中。通过细胞形态、细胞增殖,Real-time PCR、体外三维培养等检测方法对三种培养基培养的汗腺细胞的生物学特征和功能进行鉴定。结果:(1)汗腺细胞在三种不同培养基中比较性地培养一周后,混合培养基中培养的汗腺细胞呈更高的增殖率及更稳定的细胞形态;(2)Real-time PCR结果显示,混合培养基中培养的汗腺细胞所表达的标志基因(SMA,K77,CEA,K8,K18,EDAR,C-MYC,Klf-4,OCT-4)都高于SG培养基和KGM-2培养基中所培养的汗腺细胞,并经三维培养,能形成类似汗腺腺体的结构;(3)KGM-2培养基培养的细胞高表达K5,K14等角质化细胞标志基因,并能形成成熟的上皮组织。上述研究表明,含血清的培养基有利于汗腺细胞体外增殖和生物学特征的维持,而无血清的KGM-2培养基使汗腺细胞失去其生物学特征和功能的原因是,无血清培养体系中汗腺细胞会快速分化为角质化细胞。结论:本研究建立的混合培养基,不仅能有效提高汗腺细胞体外增殖能力,还能更好地维持汗腺细胞的生物学特征和功能。第二部分Sonic Hedgehog对体外培养汗腺细胞生物学特征和功能的作用目的:探讨音猬基因(Sonic Hedgehog)即Shh在汗腺细胞体外培养中的作用,进一步优化目前的汗腺细胞体外培养体系。方法:利用手术废弃的六指全层皮肤,去除表皮后,在倒置显微镜下分离出汗腺组织,并将其培养在含血清的SG培养基中(DMEM/F12+10%FBS,h EGF,Hydrocortison,Triiodothyronine,Insulin-Transferrin-selenium)。约一周后,待汗腺细胞向外增殖,将增殖的汗腺细胞分别培养在第一部分中的混合培养基和添加Shh因子的混合培养基中。通过细胞形态、细胞增殖、Real-time PCR、体外三维培养等检测方法对两种培养基培养的汗腺细胞的生物学特征和功能进行鉴定。结果:(1)汗腺细胞在两种不同培养基中培养一周后,添加有Shh混合培养基中培养的细胞同样呈汗腺细胞样形态,且其生长速率与未添加Shh的混合培养基相近;(2)Real-time PCR结果显示,添加有Shh混合培养基中培养的汗腺细胞所表达的标志基因(SMA,K77,CEA,K8,K18,EDAR,C-MYC,KLF-4,OCT-4)相比混合培养基所培养的汗腺细胞有显著提高,并与原代汗腺细胞接近;(3)经三维培养,添加有Shh混合培养基中的汗腺细胞形成汗腺样腺体的结构的数量明显多于未添加Shh的混合培养基。结论:在混合培养基中添加Shh可以更有效地维持汗腺细胞的生物学特征和功能,在体外三维组织培养中形成更多的汗腺样结构。总结本研究通过对人汗腺细胞培养基的比较,证明了混合培养基更适用于培养汗腺细胞,其中血清是维持汗腺细胞生物学特征的关键因素。在此基础上,我们在混合培养基中添加了Shh因子,证明了添加Shh因子可以提高汗腺细胞在体外三维培养中形成汗腺样结构的效率,本研究为汗腺细胞在皮肤组织工程及皮肤损伤修复上的研究奠定了基础。

关键词：人汗腺细胞培养基血清音猬基因

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人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的研究

人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的研究

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作者：圣男苏州大学

学位级别：硕士

在人体中,最大的器官是皮肤,它保护我们的机体免受外界的伤害,通过排出汗液带走多余的热量,同时皮肤还能够使我们感知冷暖并抵抗外界的压力。每年因烧伤死亡的人数不在少数。在我国,每年约有上千万人遭受不同程度的烧伤,其中有约5%左右... 详细信息

在人体中,最大的器官是皮肤,它保护我们的机体免受外界的伤害,通过排出汗液带走多余的热量,同时皮肤还能够使我们感知冷暖并抵抗外界的压力。每年因烧伤死亡的人数不在少数。在我国,每年约有上千万人遭受不同程度的烧伤,其中有约5%左右的病人需要进行住院治疗。目前的临床治疗手段对于大面积深度烧伤病人的救治有较高的成活率。但是,烧伤病人治疗后的创面处由于形成瘢痕通常会丧失正常皮肤的许多功能,而疤痕组织由于不含有汗腺,导致汗液无法正常排出体外,丧失部分皮肤的散热功能,对病人的生活质量造成了严重的影响。汗腺的发生是一个非常复杂的过程,由于汗腺细胞是终末分化的体细胞,很难在体外进行大规模的培养。对于大面积深度烧伤病人,无法从病人身上取得自体汗腺细胞,而治疗过程中病人对汗腺细胞的需求量较大,这些问题导致汗腺再生的研究和功能性皮肤重建在临床上的应用发展缓慢。鉴此,如何使汗腺再生,构建功能性皮肤,从而提高大面积深度烧伤病人的生活质量,使目前临床烧伤救治面临的新挑战,其中汗腺再生的研究已经成为重要的课题之一。近年来,随着干细胞研究的深入,在皮肤损伤修复中干细胞发挥了一定的作用,也包括了汗腺的重建,其中骨髓间充质细胞(BMSCs)被用在重度烧伤救治中。虽然研究者对干细胞分化为汗腺细胞的研究取得了一部分进展,但是汗腺分化发育的具体机制还不够明确。因此,从干细胞分化到汗腺细胞的过程中寻找汗腺分化发育的机制,为汗腺的重建研究提供基础,具有重要的临床意义。皮肤组织工程中功能性汗腺的重建工作是当今医学研究的热点和难点问题,汗腺细胞体外培养增殖传代难的问题使得汗腺的重建缺乏种子细胞,干细胞汗腺细胞分化的研究取得了一定的进展,但是在培养体系和分化机制上还存在分歧。鉴此,本课题建立了人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞。同时,本课题证明了分化后的汗腺样细胞与人羊水干细胞相似,具有低免疫原性,为体外功能性汗腺重建提供了种子细胞,具有研究的创新性及重要的临床意义。同时在分化过程中,确定了有关键作用的分子,为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供了理论基础,使汗腺的功能性重建成为可能,提高大面积烧伤病人救治后的生活质量。第一部分人羊水干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞及其生物学特性的鉴定目的:建立人羊水干细胞体外分离、培养、鉴定的方法,并建立了人外泌汗腺细胞体外分离、培养、纯化和鉴定的方法,利用条件培养基使人羊水干细胞分化为汗腺样细胞,为汗腺的功能性重建提供足够量的种子细胞。方法:(1)人羊水干细胞体外培养鉴定:将收集的羊水样本离心获得细胞,贴壁培养,用胰酶消化细胞,使用磁珠细胞分选法(MACS)对羊水细胞进行免疫磁珠分离,从中分离提取出CD117表达阳性的AFS细胞培养。用流式细胞仪技术测定AFS表面特异性抗原的表达。(2)汗腺细胞的分离培养鉴定:将婴幼儿多指样本去除皮下脂肪,放入含有双抗的PBS中浸泡,随后用PBS漂洗,用眼科剪将皮肤剪成小于1cm×1cm的组织小块,经DispaseⅡ酶4℃消化18小时,用镊子分离表皮和真皮。将去除表皮的真皮组织进一步用胶原酶Ⅳ在培养箱中消化1小时,待汗腺组织游离出,在倒置显微镜下挑取完整的汗腺组织(包括导管和腺体)用胰岛素针拉出盘旋在腺体中的部分导管,并切断导管和腺体的连接处,舍去导管和腺体的中间连接部分,将机械分离的腺体部分用汗腺培养基培养。倒置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态;PCR分析汗腺细胞基因表达;免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。(3)人AFS细胞向汗腺样细胞分化:收集汗腺腺体细胞条件培养基(CM),使用汗腺腺体分化培养基(汗腺培养基:条件培养基CM=1:1,额外添加50ng/ml的人表皮生长因子)对人AFS进行诱导分化,每天更换培养基。对分化后的汗腺样细胞进行RT-PCR,免疫荧光染色,流式细胞仪和透射电镜的检测。结果:(1)人AFS表达胚胎干细胞标记,部分表达间充质干细胞标记,不表达造血干细胞标记,其分化潜能介于ESCs和成体干细胞之间。(2)光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺,游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部;体外培养的人汗腺细胞呈典型的上皮细胞样,排列紧密,类似铺石路状,细胞边界明显,核清晰,具有一定的增殖能力;PCR结果显示,体外培养的汗腺细胞,不表达胚胎干细胞的干性指标Oct-4、Sox-2和Nanog,表达增殖相关基因Klf-4和c-Myc,表达汗腺特异性指标CEA,表达上皮细胞指标K14、K8、K18和K19;免疫荧光染色结果显示,体外培养的人汗腺细胞表达角蛋白K14、K8、K18,以及汗腺特异性指标CEA。(3)利用汗腺腺体分化培养基(SG

关键词：人羊水干细胞人汗腺细胞汗腺腺体条件培养基干细胞汗腺分化

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人体外泌汗腺细胞的三维培养及形态学观察

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中国修复重建外科杂志 2014年第2期28卷 162-166页

作者：舒申友陈露李雪雪李海红汕头大学医学院第二附属医院烧伤整形显微外科广东汕头515041

目的探讨人体外泌汗腺组织体外三维培养方法，并对构建的三维组织进行形态学分析。方法取整形手术患者自愿捐赠的正常腹部全层皮肤，经II型胶原酶消化分离人体外泌汗腺组织，以含5ng／mL重组人EGF、25mg／mL牛垂体提取物、100U／mL青霉... 详细信息

目的探讨人体外泌汗腺组织体外三维培养方法，并对构建的三维组织进行形态学分析。方法取整形手术患者自愿捐赠的正常腹部全层皮肤，经II型胶原酶消化分离人体外泌汗腺组织，以含5ng／mL重组人EGF、25mg／mL牛垂体提取物、100U／mL青霉素和100μg／mL链霉素的无血清角质细胞培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。待原代细胞达80％融合后，调整细胞浓度至l×10^5个／mL；取0-3mL细胞悬液与0．3mLMatrigel基底膜基质混匀培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养14d后，取标本行冰冻切片，HE染色观察细胞形态结构，免疫组织化学染色检测细胞角蛋白7（cytokeratin7，CK7）和CKl9抗原表达。结果倒置相差显微镜观察示，经II型胶原酶消化后大量汗腺组织游离；贴壁后3～5d长出汗腺细胞，细胞持续分裂达2～3周，形成围绕汗腺组织块的环状单层；3～4周后细胞衰老。汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质中2～3d，细胞开始分裂，随后形成小细胞团、管状结构以及类球状结构；约2周时混合培养物开始液化，培养终止。HE染色示部分细胞形成中空管状结构，管壁由1～2层细胞构成，类似于在体汗腺的分泌部和导管部；免疫组织化学染色见培养的汗腺细胞CK7和CKl9表达均呈阳性。结论人汗腺细胞接种于Matrigel基底膜基质三维培养，形成的组织结构模拟了在体汗腺的组织形态结构。

关键词：人汗腺细胞 Matrigel基底膜三维培养类汗腺结构

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