检索结果-南通市图书馆

作者：雷元君暨南大学

学位级别：硕士

蛋白和多肽类药物具有专一性强、毒性低等优点,使其近年来在医药领域成为研究热点。由于蛋白和多肽类药物存在稳定性差、保存条件要求高等问题,因此,解决蛋白类药物的稳定性问题对药物的广泛应用十分关键。FGF-2作为人体内重要的细胞因... 详细信息

蛋白和多肽类药物具有专一性强、毒性低等优点,使其近年来在医药领域成为研究热点。由于蛋白和多肽类药物存在稳定性差、保存条件要求高等问题,因此,解决蛋白类药物的稳定性问题对药物的广泛应用十分关键。FGF-2作为人体内重要的细胞因子,存在已上市的蛋白药物,也具有其他适应症应用潜能,然而FGF-2极易产生聚沉反应而失活的特性一直是其应用中的瓶颈。本研究旨在通过抗FGF-2的纳米抗体4（Nanobody4,Nb4）与其结合的方式,在不影响其生物学活性的前提下,增强其稳定性。运用高密度原核细胞发酵和Ni-RTA亲和层析纯化技术获得纯度达95%以上的Nb4和抗FGF-2的纳米抗体6（Nanobody6,Nb6）蛋白。通过摇瓶发酵和CM-Sephadex Fast Flow离子交换层析以及Heparin-sepharose CL-6B亲和层析得到FGF-2蛋白,制成0.2 mg/mL的FGF-2与Nb4混合物（FGF-2+Nb4）和对照组0.2mg/mL FGF-2,对该两类样品在不同温度（4℃、25℃、37℃、40℃）、pH（5、7、9、11）、放置时间（1到4周）、蛋白保护剂与变性剂、转速（500 rpm、1000 rpm）条件下处理。运用Western Blotting和ELISA双抗夹心法检验,再利用细胞划痕、细胞增殖实验进行验证。发现FGF-2在高温、强碱等条件下极不稳定,Nb4随着FGF-2放置时间的延长、温度的升高以及碱性环境变强的条件下对FGF-2的保护作用增强,同时发现,当1 mol/L蔗糖作为辅助蛋白保护剂时的FGF-2+Nb4组效果最好,即1 mol/L蔗糖和Nb4可组合作为蛋白保护剂备选物。

关键词：人成纤维细胞生长因子2 纳米抗体蛋白稳定性

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人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第24期14卷 4402-4406页

作者：郭伟韬刘思景王辉肖启贤陈子秋黄云王斌广东医学院附属医院骨科广东省湛江市524001

背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法。目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXatt... 详细信息

背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法。目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定。方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2。结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体。

关键词：人骨形态发生蛋白2 人成纤维细胞生长因子2 腺病毒载体内部核糖体进入位点序列转染基因治疗

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人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

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中国组织工程研究 2012年第23期16卷 4273-4278页

作者：郭伟韬王辉刘思景曾荣肖启贤陈子秋黄云王斌胡资兵广东医学院附属医院骨科广东省湛江市52400 广州中医药大学附属中山医院广东省中山市528400

背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的... 详细信息

背景:利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。目的:用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。方法:将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2cNDA和人成纤维细胞生长因子2cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Westerblot方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果与结论:转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。

关键词：腺病毒人骨形态发生蛋白2 人成纤维细胞生长因子2 骨髓基质干细胞基因转染干细胞

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