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血管紧张素Ⅱ通过抑制人心房成纤维细胞BKCa通道诱导心房纤维化

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心血管病学进展 2023年第11期44卷 1047-1052,1056页

作者：贾春森李磊李劲平谭宏伟周伟聂永梅于风旭西南医科大学附属医院心脏大血管外科四川泸州646000

目的探讨在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心房纤维化的过程中,大电导钙激活钾通道(BKCa通道)的作用机制。方法通过组织块贴壁法获取原代人心房成纤维细胞,使用免疫荧光染色进行鉴定。用浓度为500 nmol/L的AngⅡ处理人心房成纤维细胞24 h,实... 详细信息

目的探讨在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心房纤维化的过程中,大电导钙激活钾通道(BKCa通道)的作用机制。方法通过组织块贴壁法获取原代人心房成纤维细胞,使用免疫荧光染色进行鉴定。用浓度为500 nmol/L的AngⅡ处理人心房成纤维细胞24 h,实时荧光定量PCR与蛋白质印迹法用于检测处理前后纤维化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ),以及BKCa通道的α与β亚基的mRNA和蛋白表达水平,全细胞膜片钳技术检测AngⅡ处理前后的BKCa通道的电流变化。结果(1)人心房成纤维细胞经AngⅡ处理后,α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的mRNA和蛋白表达水平升高;(2)经过AngⅡ处理后,BKCa通道α及β亚基mRNA和蛋白表达水平降低;(3)人心房成纤维细胞存在功能正常的BKCa通道,具有电压依赖性;(4)人心房成纤维细胞BKCa通道的宏观电流幅度在经AngⅡ处理后降低;(5)在人心房成纤维细胞上过表达BKCa通道α亚基后,纤维化标志物α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表达受到了明显抑制。结论AngⅡ可能通过抑制人成纤维细胞BKCa通道的表达和功能来诱导人心房成纤维细胞的纤维化,并最终导致心房纤维化。

关键词：心房纤维化血管紧张素Ⅱ 人心房成纤维细胞大电导钙激活钾通道

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β受体亚型在人心房成纤维细胞增殖分泌中的作用

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中国分子心脏病学杂志 2012年第1期12卷 23-26页

作者：王国栋王雷张宇晨沈潞华北京首都医科大学康复医学院中国康复研究中心北京博爱医院心内科 100068 北京首都医科大学附属北京友谊医院心脏中心 100050

目的通过肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂干预体外培养的人心房成纤维细胞,研究β受体在成纤维细胞增殖分泌中的作用及机制。方法:取体外循环患者右心耳组织行成纤维细胞分离培养、鉴定。实验分4组,对照组(CON组)、异丙肾上腺素组(ISO组)... 详细信息

目的通过肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂干预体外培养的人心房成纤维细胞,研究β受体在成纤维细胞增殖分泌中的作用及机制。方法:取体外循环患者右心耳组织行成纤维细胞分离培养、鉴定。实验分4组,对照组(CON组)、异丙肾上腺素组(ISO组)、ISO+阿替洛尔组(ISO+ATE组)、ISO+卡维地洛组(ISO+CAR组);干预后检测上清液中羟脯氨酸含量、细胞增殖、β受体mRNA及pPKA R2蛋白的表达。结果:1,ISO+CAR组和ISO组的细胞增殖率分别为11.3%和33.8%,P0.05。3,pPKA蛋白表达:ISO+CAR组同ISO组相比,pPKA R2/β-actin分别是0.60和0.81,P人心房成纤维细胞增殖和分泌胶原;非选择性β受体拮抗剂卡维地洛可抑制成纤维细胞增殖及分泌,其机制与β2AR-pPKA R2途径有关。

关键词：人心房成纤维细胞胶原 β肾上腺素能受体蛋白激酶A

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转录辅激活因子p300在心房成纤维细胞衰老相关心房纤维化中的作用研究

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转录辅激活因子p300在心房成纤维细胞衰老相关心房纤维化中的作用...

作者：赖颖瑜南方医科大学

学位级别：硕士

目的:房颤(atrialfibrillation,AF)为临床上最常见的心律失常之一,也是一种老年人常患病,其患病率随年龄的增加而增高,但目前的防治效果仍不理想。心房纤维化是AF重要病理机制之一,与衰老密切相关。有研究表明转录辅激活因子p300可在转... 详细信息

目的:房颤(atrialfibrillation,AF)为临床上最常见的心律失常之一,也是一种老年人常患病,其患病率随年龄的增加而增高,但目前的防治效果仍不理想。心房纤维化是AF重要病理机制之一,与衰老密切相关。有研究表明转录辅激活因子p300可在转录水平调控基因表达,而p53和Smad3是其下游效应器,可分别参与衰老和纤维化。因此本研究在体外培养的人心房成纤维细胞(humanatrail fibroblasts,HAFs)和衰老小鼠模型中探究p300/p53/Smad3通路在HAFs衰老以及衰老相关心房纤维化中的作用和调控机制,为老年人AF的防治提供新思路。方法:首先,收集人左心耳组织,使用组织贴块法分离培养原代HAFs,并通过传代培养至第11代(P11),构建复制性细胞衰老模型。衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色比较 P3、P7 和 P11代细胞衰老程度的不同;Western blot检测不同代数细胞中p300、p53、Smad3等衰老和纤维化相关因子水平的变化,探究p300/p53/Smad3通路与HAFs衰老及纤维化的相关性。P11代HAFs采用不同浓度(6、9和12μmol/L)p300抑制剂姜黄素抑制p300或p300 shRNA质粒转染敲减p300;P3代HAFs则采用p300表达质粒转染上调p300表达,分别观察对细胞衰老和p53、Smad3等衰老及纤维化相关蛋白的调控作用。敲低P11代细胞中p53表达,观察对衰老和纤维化信号蛋白水平以及纤维化因子的影响;双重免疫荧光实验观察HAFs中p53和Smad3是否存在共定位。再从动物层面进行验证,将雄性C57小鼠饲养至18月龄,构建自然衰老的动物模型。采用Masson染色和Western blot检测p300、p53、Smad3等衰老和纤维化相关指标,观察随着小鼠增龄,心房组织中间质纤维化程度的改变,以及p300/p53/Smad3通路的激活情况。小鼠从12月龄开始给予不同剂量(50mg/kg/d和100mg/kg/d,6个月)的姜黄素,使用Masson染色和Western blot检测p300、p53、Smad3等衰老和纤维化相关指标,进而验证姜黄素是否可以抑制p300/p53/Smad3信号通路,减轻老龄小鼠心房间质纤维化程度。在体电生理实验,探究老龄小鼠各项电生理指标和AF易感性的变化,并验证姜黄素给药是否可以降低衰老小鼠的AF易感性。结果:随着HAFs传代,衰老细胞增加,伴随p300/p53/Smad3通路激活,以及纤维化蛋白表达增加。姜黄素抑制p300或p300 shRNA敲低p300,可以明显减少高代数即P11代细胞衰老率和抑制p53、Smad3和p21等衰老和纤维化相关因子的表达;而过表达p300则可使衰老细胞明显增加,下游的p53,Smad3,p21以及纤维化因子表达水平明显升高。此外,敲减p53亦可抑制HAFs的衰老和纤维化相关指标的增高。免疫荧光提示,p53和Smad3在HAFs的细胞核内存在共定位。在体研究结果显示,随着小鼠月龄的增加,p300/p53/Smad3通路激活,心房纤维化加剧,且AF的可诱发率明显增加,而姜黄素可以抑制老龄小鼠p300/p53/Smad3通路和心房纤维化,降低AF易感性。结论:转录辅激活因子p300可通过调控下游的p53/Smad3信号轴在心房成纤维细胞衰老和衰老相关心房纤维化中发挥重要作用。其具体的机制可能是随着年龄的增加,细胞内p300表达增加,进而激活p53,促进p53/Smad3复合物形成,激活p53/p21介导的细胞衰老及增加p53/Smad3介导的纤维化因子表达,促进衰老相关心房纤维化,最终导致AF的发生。

关键词： p300蛋白人心房成纤维细胞细胞衰老纤维化 p53/Smad3信号通路房颤

AngⅡ抑制BKca通道在心肌纤维化中的作用机制研究

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AngⅡ抑制BKca通道在心肌纤维化中的作用机制研究

作者：周伟西南医科大学

学位级别：硕士

目的:成纤维细胞的增殖及向肌成纤维细胞分化是心肌纤维化的病理基础。AngII是RAAS中最具效应的因子,可促进心肌纤维化进程。新近研究发现人心房成纤维细胞上存在大量的BKca通道,其与成纤维细胞的增殖有一定的相关性。因此,本研究拟采... 详细信息

目的:成纤维细胞的增殖及向肌成纤维细胞分化是心肌纤维化的病理基础。AngII是RAAS中最具效应的因子,可促进心肌纤维化进程。新近研究发现人心房成纤维细胞上存在大量的BKca通道,其与成纤维细胞的增殖有一定的相关性。因此,本研究拟采用体外培养人心房成纤维细胞、全细胞膜片钳技术及基因编辑等方法,探讨BKca通道在Ang II诱导心肌纤维化过程中的作用。方法:本实验采用组织块贴壁法体外培养人心房成纤维细胞传至第二代并分为三组:对照组,不做任何处理;Ang II组,500 nmol/L Ang II干预细胞;过表达BKcaα亚基组,脂质体转染重组质粒(CMV/KC NMA1/IRES/acGFP1)至细胞。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测干预前后纤维化标记物(α-SMA,Collagen I,Collagen)和BKcaα及β亚基的mRNA和蛋白质表达水平,全细胞膜片钳技术(Whole-cell patch clamp technique)记录Ang II作用前后的BKca电流的变化。电流变化观察指标:1)人心房成纤维细胞细胞上BKca通道电流的基本特点;2)AngII对成纤维细胞上BKca通道电流的作用。结果:1)Ang II上调人心房成纤维细胞上α-SMA,Collagen I,Collagen III的mRNA和蛋白质表达。?与对照组相比,500 nmol/L Ang II作用成纤维细胞24h后,明显上调成纤维细胞上α-SMA(0.893±0.058 vs 0.282±0.072,P=0.004)、Collagen I(0.858±0.060 vs 0.306±0.058,P=0.018)、Collagen III(0.946±0.054 vs 0.447±0.041,P=0.030)的mRNA表达,差异具有统计学意义。?与对照组相比,500nmol/langii刺激成纤维细胞24h后,明显上调成纤维细胞上α-sma(0.967±0.038vs0.732±0.037,p=0.020)、collageni(0.857±0.010vs0.505±0.010,p=0.020)、collageniii(0.975±0.030vs0.626±0.010,p=0.009)的蛋白质表达水平,差异具有统计学意义。2)angii可明显下调成纤维细胞上bkcaα及β亚基mrna和蛋白质表达水平。?与对照组相比,500nmol/langii作用成纤维细胞24h后,明显下调bkcaα亚基(9.930±0.952vs0.709±0.223,p=0.001)及bkcaβ亚基(5.039±0.268vs1.390±0.640,p=0.020)的mrna表达水平。?与对照组相比,500nmol/langii作用于人心房成纤维细胞上72h后,明显下调bkcaα(0.781±0.0728vs1.232±0.043,p=0.006)及bkcaβ(0.872±0.0530vs1.333±0.502,p=0.001)的蛋白表达水平。3)人心房成纤维细胞上bkca通道电流的特性:?该通道具有内向整流性及电压依赖性,可被ibtx特异性阻断;?angii预处理24小时后可明显抑制成纤维细胞上bkca的宏观电流幅度,在+60mv电压时,bkca电流密度从31.054±2.900下降到13.508±3.000。4)过表达bkcaα亚基(cmv/kcnma1/ires/acgfp1)对成纤维细胞上α-sma,collageni,collageniii的mrna和蛋白质表达的影响。?与对照组相比,过表达bkca后可明显下调α-sma(0.524±0.097vs1.219±0.150,p=0.007)、collageni(0.482±0.084vs1.023±0.134,p=0.020)、collageniii(0.664±0.010vs1.081±0.138,p=0.036)的mrna表达水平,差异具有统计学意义。?与对照组相比,过表达bkca后可明显下调α-sma(0.391±0.015vs0.732±0.037,p=0.001)、collagen(0.227±0.010vs0.505±0.010,p=0.001)、collageniii(0.156±0.040vs0.626±0.010,p=0.008)的蛋白质表达水平,差异具有统计学意义。结论:本研究从体外培养细胞水平证实:1)Ang II可诱导心肌纤维化。2)Ang II可抑制人心房成纤维细胞上BKca的mRNA和蛋白质表达及电流强度。3)过表达BKca可明显下调纤维化指标的表达。4)Ang II通过抑制BKca通道的活性从而促进心肌纤维化进程,其机制可能是Ang II抑制了成纤维细胞上BKca的电流。提示BKca

关键词：心肌纤维化血管紧张素II 人心房成纤维细胞大电导钙激活钾通道

心房颤动患者人成纤维细胞的单细胞RNA序列的生物信息学分析

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中国现代医生 2023年第9期61卷 1-6,30页

作者：周科向杰张长江张莉湖北民族大学附属民大医院心血管内科湖北恩施445000

目的筛选心房颤动(atrial fibrillation,AF)促纤维化的关键基因及信号通路,探讨AF诱导的人心房成纤维细胞的促纤维化重塑的分子机制。方法从公共基因数据库(gene expression omnibus,GEO)下载单细胞RNA序列表达谱GSE148506,通过主成... 详细信息

目的筛选心房颤动(atrial fibrillation,AF)促纤维化的关键基因及信号通路,探讨AF诱导的人心房成纤维细胞的促纤维化重塑的分子机制。方法从公共基因数据库(gene expression omnibus,GEO)下载单细胞RNA序列表达谱GSE148506,通过主成分分析和T分布式随机邻接嵌入得到差异基因,利用SingleR软件包进行细胞类型注释和轨迹分析,使用Clusterprofiler软件包,对成纤维细胞的差异基因进行基因本体(geneontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genome,KEGG)信号通路分析。利用在线STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质相互作用网络和模块分析。利用插件CytoHubba筛选出关键基因。结果共得到6个细胞类型注释群,包括成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞。共鉴定出367个成纤维细胞差异基因,包括37个下调基因和330个上调基因。GO功能富集分析结果显示,成纤维细胞的差异基因生物过程主要富集于细胞外基质组织等;细胞组成主要富集于含胶原细胞外基质等;分子功能主要富集于细胞外基质结构成分等。KEGG信号通路分析表明,差异基因主要富集于黏着斑、细胞外基质-受体相互作用等。STRING分析从蛋白质网络互作图中鉴定出6个成纤维细胞关键基因,即FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN。结论利用生物信息学分析,鉴定出FN1、TIMP1、LAMB1、FBN1、C3、VCAN在内的基因及黏着斑、细胞外基质-受体相互作用、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白酶信号通路和转化生长因子-β信号通路可能是AF诱导的人心房成纤维细胞促纤维化重塑的重要分子机制。

关键词：心房颤动单细胞RNA序列人心房成纤维细胞生物信息学分析

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