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山东化工 2017年第19期46卷 195-197页

作者：韩明睿王冬瑞张牛冰金洳西蔡雨阳宁艳娜李迪肖保林洪军河南大学生命科学学院河南开封475000

天然过氧化物酶是一种以铁卟啉血红素(heme)为辅基,参与生命体内生理代谢的主要酶类之一。因为天然酶具有极易变性失活,提取相对困难,价格比较昂贵的缺点。故通过人工的技术手段制取价格低廉,性能稳定的人工酶。而对于人工过氧化酶的研... 详细信息

天然过氧化物酶是一种以铁卟啉血红素(heme)为辅基,参与生命体内生理代谢的主要酶类之一。因为天然酶具有极易变性失活,提取相对困难,价格比较昂贵的缺点。故通过人工的技术手段制取价格低廉,性能稳定的人工酶。而对于人工过氧化酶的研究,技术手段就显得尤为重要。本文通过分析不同的技术手段:紫外分光光度计时间扫描研究过氧化物酶活性,圆二色光谱法研究蛋白质二级结构,紫外分光光度计光谱扫描研究蛋白质广谱结构,电化学法研究电子传递效应描述了自组装人工过氧化物酶构建及应用,分析人工过氧化物酶研究技术手段现状。

关键词：人工过氧化物酶紫外可见光分光光度法圆二色光谱法电化学法自杀性失活研究

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新型自组装纳米胶团人工过氧化物酶研究

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广州化工 2014年第16期42卷 34-37页

作者：杨天杨晓璐张钰帅耿方勇康慧茹肖保林洪军穆萨维姆瓦赫迪河南大学生命科学学院河南开封475000 河南大学生物工程研究所河南开封475000 伊朗德黑兰大学生物化学与生物物理研究所

十二烷基肌氨酸钠与天然细胞色素c通过自组装方式构建了一种新型纳米胶团结构人工过氧化物酶(Artificial Peroxidase,AP)。采用紫外可见光分光光度计对AP酶促反应过程进行研究。表明AP在较宽的pH范围具有活性,并在pH 5.0,100 mmol/L磷... 详细信息

十二烷基肌氨酸钠与天然细胞色素c通过自组装方式构建了一种新型纳米胶团结构人工过氧化物酶(Artificial Peroxidase,AP)。采用紫外可见光分光光度计对AP酶促反应过程进行研究。表明AP在较宽的pH范围具有活性,并在pH 5.0,100 mmol/L磷酸盐缓冲液中达到最大。该AP的米氏常数Km、催化速率kcat以及催化效率分别为1.70μmol/L、0.11 s-1、0.065μM-1s-1,催化效率为天然辣根过氧化物酶的90.2%。

关键词：细胞色素c 人工过氧化物酶十二烷基肌氨酸钠纳米胶团催化效率

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一种基于纳米胶团自组装结构人工过氧化物酶

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广州化工 2013年第3期41卷 52-54页

作者：赵莹雪洪军杨卫云肖保林高云飞杨天河南大学生命科学学院河南开封475000

用十二烷基硫酸钠与血红素和组氨酸通过自组装的方式构建了一种纳米结构人工过氧化物酶(AP)。利用紫外可见光分光光度仪测量AP结构酶促反应过程,观察到了过氧化物酶活性在pH 8.0,50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液时达到最大。该AP的... 详细信息

用十二烷基硫酸钠与血红素和组氨酸通过自组装的方式构建了一种纳米结构人工过氧化物酶(AP)。利用紫外可见光分光光度仪测量AP结构酶促反应过程,观察到了过氧化物酶活性在pH 8.0,50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液时达到最大。该AP的米氏常数Km、催化速率以及催化效率分别为5.5μmol/L、0.6 s-1、0.011μM-1.s-1,其催化效率为天然辣根过氧化物酶的15%。

关键词：自组装人工过氧化物酶纳米胶团催化效率

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基于微凝胶-胶束体系的人工过氧化物酶的构建

基于微凝胶-胶束体系的人工过氧化物酶的构建

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中国化学会2017全国高分子学术论文报告会

作者：石贺锦马如江史林启南开大学

酶是由蛋白质多肽与活性中心通过多级组装形成的大分子催化剂,具有较高的催化活性以及独特的底物选择性,因此在生物、医药等领域均有广泛应用。利用仿生手段模拟天然酶的结构和功能,构建具有催化活性以及选择性的人工酶体系具有重大意... 详细信息

酶是由蛋白质多肽与活性中心通过多级组装形成的大分子催化剂,具有较高的催化活性以及独特的底物选择性,因此在生物、医药等领域均有广泛应用。利用仿生手段模拟天然酶的结构和功能,构建具有催化活性以及选择性的人工酶体系具有重大意义。本文利用聚乙二醇-b-聚4-乙烯基吡啶（PEG-b-P4VP）与血红素自组装得到胶束,进而在胶束表面原位聚合生成微凝胶,构建微凝胶-胶束复合体系。聚合物胶束的形成可以有效地抑制血红素氧桥联二聚体的生成,将血红素稳定于水相体系中,具有较好的催化活性及稳定性。微凝胶网络结构通过改变底物分子的扩散方式,影响底物分子与血红素胶束的结合,从而赋予该体系对不同尺寸的底物分子的催化选择性。向微凝胶内共聚具有底物识别功能的单体,通过功能单体与底物之间的非共价相互作用,来进一步实现人工酶的底物选择性。通过构建这样一种微凝胶-胶束复合体系,可以得到同时具有催化活性以及底物选择性的人工酶。

关键词：人工过氧化物酶自组装微凝胶-胶束催化底物选择性

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血红素-GroEL超分子过氧化物酶体系的仿生构建及其在催化氧化中的应用研究

血红素-GroEL超分子过氧化物酶体系的仿生构建及其在催化氧化中的...

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中国化学会第十六届胶体与界面化学会议

作者：王超潘美红陈韩陆欣伟刘真真徐宝美王小强中国石油大学(华东)重质油国家重点实验室生物工程与生物技术中心

本实验从过氧化物酶（HRP）中获得灵感,以纳米筒状的大肠杆菌分子伴侣GroEL为基础构建了人工过氧化物酶。该酶通过透析、由血红素与GroEL超分子自组装形成,具有类似过氧化物酶的活性。GroEL通过其顶端疏水区域,与血红素通过疏水相互作... 详细信息

本实验从过氧化物酶（HRP）中获得灵感,以纳米筒状的大肠杆菌分子伴侣GroEL为基础构建了人工过氧化物酶。该酶通过透析、由血红素与GroEL超分子自组装形成,具有类似过氧化物酶的活性。GroEL通过其顶端疏水区域,与血红素通过疏水相互作用形成超分子复合体,同时给底物提供开放的结合位点。GroEL蛋白的水溶性及其疏水区域与血红素的相互作用既能抑制血红素二聚体的形成,又提高了血红素在水相中的稳定性。在显色底物氧化反应中,血红素-GroEL超分子体系表现出了良好的催化氧化活性,该研究为新型超分子酶体系的构建和应用提供了理论指导。

关键词：分子伴侣GroEL 血红素超分子体系疏水相互作用人工过氧化物酶

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血红蛋白及血红素结构的光谱和电化学研究

血红蛋白及血红素结构的光谱和电化学研究

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作者：赵莹雪河南大学

学位级别：硕士

以血红素为活性中心的氧化还原蛋白酶直接电化学的研究是目前生物电化学研究的热点，比如血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)、辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素c(Cty c)等蛋白酶在电化学方面的研究报道有很多。通过研究血红素... 详细信息

以血红素为活性中心的氧化还原蛋白酶直接电化学的研究是目前生物电化学研究的热点，比如血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)、辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶(CAT)、细胞色素c(Cty c)等蛋白酶在电化学方面的研究报道有很多。通过研究血红素蛋白酶与电极间的电子传递过程，可以了解生物体内电子传递机理和生理作用机理，也为第三代蛋白酶生物传感器的研发提供了理论基础。人工模拟生物体内蛋白酶的方法技术对解决天然蛋白酶的局限性以及代替天然蛋白酶用于生物学和化学分析等都很重要的意义。本实验采用高分子纳米复合功能化材料将血红蛋白固定在玻碳电极上，通过循环伏安法研究了血红蛋白的直接电化学特性，采用线性扫描和时间电流测试了修饰电极对过氧化氢(HO)的催化响应。结果表明：血红蛋白受电极表面控制影响，血红蛋白被成功固定在电极表面并能进行有效地直接电子转移，血红蛋白与电极之间氧化还原反应为单电子传递过程，电子传递率ks为4.2±0.2s;通过电流时间法测试出该电极能保持对HO还原的生物催化活性对HO有响应，其检测范围为0.05～1nM，最低检测限为0.05(±0.01nM)。测得血红蛋白的表观米氏常数Kmapp为0.85(±0.1) nM。实现了对HO高灵敏度低检测限的检测，为研制出第三代痕量HO生物传感器奠定了基础。本实验采用半合成酶制备的原理，用内部疏水的SDS结构模拟酶的外部结构，用小分子的血红素和组氨酸模拟酶的内部催化活性结构，通过自组装的方式以天然辣根过氧化物酶(HRP)为特征构建了人工过氧化物酶，模拟其催化活性并应用于生物电化学的研究。首先，本工作采用光谱学法对由50mM SDS纳米胶团和10μM血红素(heme)-50mM组氨酸(His)溶液自组装构建的人工过氧化物酶的催化能力、结构、酶动力学、自杀性失活进行了研究。结果表明：采用愈创木酚氧化法测定人工过氧化物酶、heme及天然HRP的表观催化活性，观察到了人工过氧化物酶具有良好的催化过氧化氢及愈创木酚发生氧化反应的活性，且人工过氧化物酶在pH8.0时表现出较高的表观活性;在临界胶团浓度(CMC)以上，SDS胶团的浓度对人工过氧化物酶的活性几乎没有影响，组氨酸浓度对人工过氧化物酶的活性有一定影响，在一定浓度范围内会随着His浓度增加而增加;测试得到其具有可观的催化效率，其中酶动力学参数Km值为5.5μM，催化速率常数为0.06s，人工过氧化物酶催化效率为0.011μMs，相当于天然HRP催化效率的15%。本文还测试了人工过氧化物酶在高浓度HO下的稳定性，数据显示人工过氧化物酶会随着HO浓度的增加反应速度增加，在酸性环境中，人工过氧化物酶对高浓度HO抵抗能力强，但反应速度比较慢;而人工过氧化物酶在碱性环境中，抵抗底物自杀性失活能力比较弱，但酶反应速度最快，说明低pH溶液有助于结构稳定，高pH溶液有利于活性的提高。再者，采用电化学分析法对人工过氧化物酶的电化学特性进行了研究。本实验将人工过氧化物酶固定在高分子纳米复合材料修饰的玻碳电极上。通过循环伏安法进行研究，结果表明，人工过氧化物酶在电极表面能进行有效地直接电子转移且为固化机制;并且通过该电极对HO进行线性扫描法检测，结果表明固定在电极表面的人工过氧化物酶能够保持其生物催化活性，可以实现对底物过氧化氢的检测，电化学法测得人工过氧化物酶的表观米氏常数Kmapp为1.57mM，为生物电化学研究扩展了研究对象并为人工过氧化物酶的研究提供了一种新思路、新方法。

关键词：血红蛋白人工过氧化物酶自组装直接电化学光谱学

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导电纳米材料在过氧化氢传感器中的应用

导电纳米材料在过氧化氢传感器中的应用

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作者：马丽萍西南大学

学位级别：硕士

自从1967年Updik和Hicks研制出第一支以铂电极为基体的葡萄糖氧化酶生物传感器以来,酶生物传感器由于其方法简单、灵敏度高、选择性好等特点而越来越受到了人们的广泛关注并取得迅猛的发展。目前,酶生物传感器已用于多种成分的测定。由... 详细信息

自从1967年Updik和Hicks研制出第一支以铂电极为基体的葡萄糖氧化酶生物传感器以来,酶生物传感器由于其方法简单、灵敏度高、选择性好等特点而越来越受到了人们的广泛关注并取得迅猛的发展。目前,酶生物传感器已用于多种成分的测定。由于HO是很多工业过程的原料或中间产物,同时也是生物体内许多氧化酶反应的副产物,因而对其含量的测定在食品、工业、临床、药物和环境分析中具有十分重要的意义并已成为当前研究的热点之一。由于辣根过氧化物酶(HRP)和血红蛋白(Hb)对HO具有高选择性,因此,研制HRP和Hb生物传感器用于HO含量的测定是目前最为热门的研究课题。然而,由于酶分子难于固定到电极表面,酶本身易失活且酶分子量大,酶的活性中心深埋在多肽结构内部,很难发生直接电子传递,因此如何有效的利用生物分子固定技术及固定材料来保持酶的活性、提高酶的固载量以及加速电子传递速率或直接研制新型的无酶型传感器是制备性能优良的HO传感器的关键问题和当务之急。基于此,本文主要研究工作如下: 1.以共价法固定硫堇为媒介体的过氧化氢生物传感器的研究近年来的研究表明,电子媒介体以及纳米金属材料的引入能显著加速电子传输速率、增大生物分子的固载量以及提高传感器的灵敏度。因此,从引入并增强电子媒介体的稳定性以及增加纳米金的固定量,进而提高传感器的性能方面考虑,并结合电沉积和吸附法的优点,研制了一种新型的过氧化氢传感器。首先电聚合一层2,6-吡啶二甲酸,使电极表面带上丰富的羧基,从而为电子媒介体(硫堇)以共价交联法有效的固定到电极表面提供了活化基底。其次,采用被称为“零长交联剂”的活化剂(EDC和NHS)使聚2,6-吡啶二甲酸的羧基与硫堇的氨基发生酰胺反应,从而使硫堇固定到电极表面。再在制得的硫堇电极表面直接电沉积HAuCl,使电极表面形成一层纳米金粒子。最后将此电极吸附辣根过氧化物酶制得HO生物传感器。实验表明,该生物传感器对HO响应的线性范围为9.1μmol/L～5.0 mmol/L,检测限为2.6μmol/L(S/N=3),米氏常数为3.15 mmol/L,表明所固定的酶具有较高的生物活性。 2.基于DNA-Ag纳米复合物和PDDA保护的Au纳米颗粒为载体的过氧化氢传感器的研究到目前为止,许多材料已经被用来固定酶分子,如:量子点,聚合物,介孔材料和纳米材料等。而在这些材料中,纳米材料,尤其是功能化的纳米复合材料由于其独特的物理、化学性质而被广泛的应用在生物传感器的研制中。然而,有些纳米复合材料的导电性并不是很好,从而在一定程度上降低了传感器的灵敏度和准确度。因此,它们在传感器的应用上受到了很大的限制。我们利用DNA-Ag纳米复合物和PDDA保护的Au纳米颗粒共固定HRP,从而构建出一种新型的过氧化氢生物传感器。首先将DNA-Ag电化学还原为带负电的DNA-Ag。然后通过静电作用力吸附带正电的PDDA保护的Au纳米颗粒,并再次利用同样方法将DNA-Ag修饰到电极上。最后再利用DNA-Ag吸附带正电的辣根过氧化物酶制得过氧化氢生物传感器。由于该法结合了无机导电金属材料(Au,Ag)和有机聚合物(PDDA,DNA)的优越性能,因此该生物传感器对HO表现出较好的电催化活性。还原电流与HO浓度在7.0μmol/L到7.8 mmol/L范围内呈现良好的线性关系,检测下限为2.0μmol/L(S/N=3),米氏常数为1.3 mmol/L。此外,该传感器还具有较高的灵敏度和可接受的稳定性。 3.基于普鲁士蓝纳米棒与金纳米链共修饰的电化学传感器的研究由于酶分子的一些缺陷导致酶传感器存在较差的稳定性和重现性以及具有较低的灵敏度。为了尽可能的减小或消除这些缺陷,利用化学修饰电极(即无酶修饰电极)来实现对过氧化氢的直接电催化受到了研究者们的广泛关注。这也将成为未来检测过氧化氢的一种趋势。我们选用碳纳米管为模板合成普鲁士蓝纳米棒(PB@MWCNTs)作为“人工过氧化物酶”。然后再用壳聚糖将这种“人工过氧化物酶”(PB@MWCNTs)固定到金电极上,从而构建出新型的无酶型过氧化氢传感器。由于壳聚糖的导电性较差,我们将比表面积大、生物相容性好以及导电性强的金纳米链引入到我们的传感器中。当金纳米颗粒被合成为金纳米链时,它将更有利于形成电子通道,缩短电子转移的有效距离。由于结合了PB@MWCNTs和金纳米链的优点,实验发现,采用该法构建的传感器不仅具电流响应快,线性范围宽,检测下限低等优点。而且由于不需要引入酶分子,所以构造步骤相对简单,成本更加低廉,稳定性和重现性也更加令人满意。

关键词：过氧化氢传感器导电纳米材料有机无机复合物人工过氧化物酶

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基于分子印迹构建具有底物选择性的肽组装人工模拟酶

基于分子印迹构建具有底物选择性的肽组装人工模拟酶

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作者：朱明杰天津大学

学位级别：硕士

本文以短肽Fmoc-Phe-Phe-His-COOH(Fmoc-FFH)为基本组装单元,通过其自组装并与分子印迹聚合物结合,获得分子印迹肽组装人工水解酶;利用Fmoc-FFH与血红素(Hemin)共组装,并结合分子印迹聚合物,构建得到分子印迹肽组装人工过氧化物酶。借... 详细信息

本文以短肽Fmoc-Phe-Phe-His-COOH(Fmoc-FFH)为基本组装单元,通过其自组装并与分子印迹聚合物结合,获得分子印迹肽组装人工水解酶;利用Fmoc-FFH与血红素(Hemin)共组装,并结合分子印迹聚合物,构建得到分子印迹肽组装人工过氧化物酶。借助多种表征、分析手段对分子印迹肽组装模拟酶的形貌、结构、催化活性以及底物选择性进行了研究,主要结论如下:(1)基于分子印迹构建了具有底物选择性的肽组装水解酶:Fmoc-FFH能在非共价作用下自组装形成纳米纤维SA-H,并表现出类似酯酶的催化水解活性。借助分子印迹在SA-H纳米纤维的表面形成具有p-NPA结合位点的印迹聚合物层,得到了分子印迹肽组装水解酶AMIP-H。AMIP-H保持了纳米纤维形貌和β-折叠的活性二级结构,符合米氏动力学方程,其催化p-NPA水解的活性是SA-H的2.5倍,在更宽温度和pH下表现出更高的催化活性,并可回收重复使用。此外,我们还证明了通过改变印迹模板(如:p-NPA,p-NPB,p-NPH)可以实现对肽组装水解酶底物选择性的定制。(2)基于分子印迹构建了具有底物选择性的肽组装过氧化物酶:Fmoc-FFH能与Hemin在非共价作用下共组装形成纳米纤维SA-H/Hemin。在ABTS与HO为底物的反应中,SA-H/Hemin表现出过氧化物酶的活性。借助分子印迹在SA-H/Hemin纳米纤维表面形成具有ABTS结合位点的印迹聚合物层,得到分子印迹肽组装过氧化物酶SMIP-H/Hemin,其保持了纳米纤维形貌和β-折叠的活性二级结构,具有更高的底物亲和力,反应符合米氏动力学方程。与SA-H/Hemin相比,SMIP-H/Hemin催化ABTS活性提高了2.4倍,且在更宽的温度和pH范围下保留更高的催化活性。进一步,通过在印迹过程中引入阳离子单体,制备了正电性的SMIP-H/Hemin。结果证明,其对负电性底物ABTS催化活性进一步提高至SA-H/Hemin的6.3倍,而对正电性底物TMB的催化活性却有所降低,由此得到了对ABTS具有较高催化选择性的肽组装过氧化物酶。

关键词：肽组装分子印迹人工水解酶人工过氧化物酶底物选择性

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